Megasphaera elsdenii und Saccharomyces Cerevisiae als direkt gefütterte Mikroben während einer In-vitro-Provokation mit akuter Pansenazidose

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 7978 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Ziel dieser Studie war es, die Wirkung von Saccharomyces cerevisiae und Megasphaera elsdenii als direkt gefütterte Mikroben (DFM) in Mastrinder-Endfuttermitteln zu bewerten, um die akute Pansen-Laktatazidose in vitro zu lindern. Es wurde ein kontinuierliches Dual-Flow-Kultursystem verwendet. Bei den Behandlungen handelte es sich um eine Kontrolle, kein DFM; YM1, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 1; YM2, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 2; und YMM, S. cerevisiae und die Hälfte der Dosen von M. elsdenii Stamm 1 und Stamm 2. Jede DFM-Dosis hatte eine Konzentration von 1 × 108 KBE/ml. Vier Versuchszeiträume dauerten jeweils 11 Tage. An den nichtazidotischen Tagen (Tag 1–8) enthielt die Nahrung ein Verhältnis von Futter zu Kraftfutter von 50:50. An den Herausforderungstagen (Tag 9–11) enthielt die Nahrung ein Verhältnis von Futter zu Kraftfutter von 10:90. Eine akute Pansenazidose konnte erfolgreich festgestellt werden. Zwischen den Behandlungen wurden keine Unterschiede im pH-Wert, d-, l- oder Gesamtlaktat beobachtet. Propionsäure stieg bei Behandlungen mit DFM an. Beim N-Metabolismus verringerte die YMM-Behandlung den Proteinabbau und die mikrobielle Proteinsynthese. Es wurden keine Behandlungseffekte auf die NH3-N-Konzentration beobachtet; Allerdings lag die Effizienz der N-Verwertung durch Pansenbakterien während des Belastungszeitraums bei mehr als 80 %, und die NH3-N-Konzentration sank mit fortschreitender Belastung auf etwa 2 mg/dl.

Akute Pansenazidose ist eine schwerwiegende Verdauungsstörung bei Wiederkäuern und bleibt eine der größten Herausforderungen für die Rinderindustrie1,2,3. Der abrupte Anstieg des Verbrauchs an schnell fermentierbaren Kohlenhydraten zusammen mit einem Rückgang des Verbrauchs an faserigen Kohlenhydraten (z. B. beim Eingang in die Futterstelle und beim Sortierverhalten) führt zu einem Ungleichgewicht in der Pansenfermentation1,4. Im Pansen werden schnell vergärbare Kohlenhydrate in flüchtige Fettsäuren (VFA) und Milchsäure umgewandelt. Stoffwechsel, Absorption und Abfluss dieser Säuren dürfen nicht größer sein als ihre Produktion3. Daher kann die Ansammlung von Säuren, insbesondere Milchsäure, den pH-Wert im Pansen unter 5,2 senken, was die Pansengärung beeinträchtigen kann2.

Milchsäure ist eine stärkere Säure im Vergleich zu anderen im Pansen vorkommenden VFA (pKa von 3,9 bzw. 4,9) und Pansenbakterien, die Milchsäure verstoffwechseln (z. B. Megasphaera elsdenii), wachsen nicht so schnell wie solche, die Milchsäure produzieren (z. B , Streptococcus bovis; Nocek, 1997; Russell und Rychlik, 2001). Daher besteht eine Möglichkeit zur Überwindung einer akuten Pansenazidose darin, die undissoziierte Milchsäure im Pansen durch die Ergänzung mit mikrobiellen Futterzusätzen zu verringern, die Milchsäure verstoffwechseln können. Saccharomyces cerevisiae ist ein wichtiger direkt gefütterter Mikroorganismus (DFM), der untersucht wurde, um die Ansammlung von undissoziierter Milchsäure im Pansen zu verringern5. In einer Metaanalyse von Studien, in denen S. cerevisiae als DFM zur Modulation der Pansengärung verwendet wurde, berichteten Desnoyers et al.6, dass S. cerevisiae die Laktatkonzentration im Pansen senkte und die Trockenmasseaufnahme (DMI), den pH-Wert im Pansen, die OM-Verdaulichkeit und den VFA erhöhte verschiedene Wiederkäuerarten. Da S. cerevisiae durch die Sauerstoffbindung eine reduziertere Umgebung im Pansen fördert, kann eine akute Pansenazidose durch eine S. cerevisiae-Supplementierung aufgrund der Vermehrung fibrolytischer Bakterien und der Fasergärung im Pansen gelindert werden5. Obwohl S. cerevisiae zur Milchsäuremetabolisierung beiträgt, kann die Konzentration von undissoziierter Milchsäure während einer akuten Pansenazidose mehr als eine DFM erfordern, um das Pansenmilieu wirksam zu verbessern.

Mögliche Kombinationen können die Verwendung von Milchsäure beinhalten, die bereits im Pansen vorkommende Bakterien wie M. elsdenii7, Selenomonas ruminantium8 und Propionibacterium freudenreichii9 nutzt. Insbesondere M. elsdenii ist am vielversprechendsten, da dieses Bakterium bereits das wichtigste Milchsäure verwertende Bakterium im Pansen ist und unter normalen Bedingungen bis zu 80 % der gesamten Milchsäuregärung zu Propionsäure ausmacht10. Es wurde berichtet, dass Megasphaera elsdenii Milchsäure fermentiert, bis diese aufgebraucht ist, da Milchsäure von M. elsdenii etwa sechsmal schneller fermentiert wird als Glucose11,12; Dies macht dieses Bakterium zu einem starken DFM-Kandidaten für den Einsatz bei akuter Pansenazidose. Obwohl einige Stämme von M. elsdenii als DFM zur Vorbeugung von Azidose patentiert wurden13,14, haben nur wenige andere Stämme die akute Pansenazidose erfolgreich gelindert15,16.

Daher waren die Ziele dieser Studie: (1) die Auslösung einer akuten Pansen-Laktatazidose in einem kontinuierlichen Dual-Flow-Kultursystem; und (2) um die Auswirkungen der Fütterung von S. cerevisiae in Kombination mit zwei neu isolierten Stämmen von M. elsdenii (isoliert aus dem Pansen von Rindern unter akuter Azidose) als DFM bei akuter Pansen-Laktatazidose zu bewerten. Die Hypothese war, dass ein akutes Pansenazidose-Szenario erfolgreich in vitro induziert werden konnte, indem die Ernährung der Dual-Flow-Fermenter mit kontinuierlicher Kultur abrupt geändert wurde. Die zweite Hypothese war, dass eine Kombination von S. cerevisiae mit beiden M. elsdenii-Stämmen die Milchsäureansammlung während dieser Ernährungsumstellung (Challenge) erheblich verringern und die Pansenfermentation verbessern würde. Hier stellen wir ein Modell zur Simulation einer Pansenazidose vor und beschreiben Methoden zur Bewertung der möglichen Auswirkungen von DFM zur Linderung solch schwieriger Erkrankungen.

Eine kürzlich veröffentlichte Metaanalyse mit 155 veröffentlichten Artikeln hat die Zuverlässigkeit des kontinuierlichen Dual-Flow-Kultursystems im Vergleich zu In-vivo-Bedingungen gezeigt17. Daher bestand eines der Ziele der Studie darin, ein Szenario einer akuten Pansenazidose in den Dual-Flow-Fermentern für kontinuierliche Kultur zu erstellen. Trotz der Solidität dieser Methodik sollten die Ergebnisse sorgfältig geprüft werden, bevor In-vivo-Anwendungen vorgeschlagen werden. Da dieses System andererseits eine präzise Kontrolle der Futteraufnahme und der Pansenverdünnungsraten (sowohl flüssige als auch feste Flüsse) ermöglicht, die in vivo nicht möglich sind, können wir solche Effekte isolieren, um diese Ernährungsstörung besser beurteilen zu können. Obwohl sich die wichtigsten Übersichten in der Literatur darin unterscheiden, was als akzeptabler pH-Schwellenwert für eine akute Pansenazidose gilt (pH < 5,2 bei Owens et al.1 vs. pH < 5,0 bei Nagaraja und Titgemeyer2), besteht Einigkeit darüber, dass eine akute Pansenazidose charakterisiert ist nicht nur durch das Vorkommen, sondern auch durch das Ausmaß, in dem der pH-Wert unter den normalen Fermentationsbedingungen liegt (durchschnittlicher täglicher pH-Wert < 5,8)2,18,19. In Abb. 1 wird gezeigt, dass der pH-Wert an dem Tag, an dem die Ernährung umgestellt wurde, den Zustand einer subakuten Pansenazidose (SARA) erreicht hat und an den Tagen 1 und 2 des Belastungszeitraums den Schwellenwert von 5,2 erreicht hat. Der durchschnittliche pH-Wert, die Stunden unter pH 5,2 und die Fläche unter pH 5,2 fielen während des gesamten Belastungszeitraums unter die normalen Fermentationsbedingungen (pH < 5,6) und blieben an den Tagen 1 und 2 relativ zur Belastung unter Azidosebedingungen. Dies sind wichtige Indikatoren im Dual-Flow-Kontinuierlichen Kultursystem im Vergleich zu In-vivo-Modellen, da sie eine längere Exposition gegenüber dem Problem darstellen, die in vivo das Potenzial hätte, erhebliche physiologische Reaktionen hervorzurufen1,2,20. Insgesamt gab es keine signifikante Wechselwirkung oder Behandlungswirkung auf die Verbesserung der akuten Pansenazidose-Bedingungen, obwohl die YMM-Behandlung die einzige Behandlung war, die die Schwellenwerte für den pH-Wert der akuten und subakuten Pansenazidose bis zum Ende der Tage 1 und 2 relativ zur Belastung numerisch überschritt. Da berichtet wurde, dass der Metabolismus von M. elsdenii stärker durch den pH-Wert als durch die Substratkonzentration reguliert wird21, besteht die Möglichkeit, dass die YMM-Mischung diesen Mechanismus leicht herunterregulierte und unter solchen Bedingungen besser funktionierte.

Dynamik des Fermentations-pH-Werts nach der Morgenfütterung, Fläche unter der Kurve (AUC) und Zeit in SARA und unter pH 5,2 an den Tagen 8, 9, 10 und 11 jeder Periode, um die Tage − 1, 0, 1 und darzustellen 2 relativ zur Herausforderung; Tag 7 wurde als Kovariate für das Modell verwendet. Alle Behandlungen hatten die gleiche Grundnahrung (1 ml jedes DFM wurde pro Tag mit 1 × 108 KBE/ml angewendet); Behandlungen waren: Kontrolle, Träger von Zusatzstoffen ohne DFM; YM1, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 1; YM1, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 2; YMM, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 1 (1/2 Dosis) und Stamm 2 (1/2 Dosis). Statistische Unterschiede wurden bei P ≤ 0,05 oder als unterschiedlicher Trend angegeben, wenn P > 0,05 und < 0,10.

Angesichts der fehlenden Wirkung auf die Linderung der Azidosebelastung waren die in der Studie verwendeten S. cerevisiae und neuen Stämme von M. elsdenii wahrscheinlich nicht wirksam bei der Reduzierung der Laktatkonzentration während der Fermentation. Die in der vorliegenden Studie verwendeten Stämme von M. elsdenii wurden während einer akuten Pansenazidose aus dem Pansen isoliert; Daher wurde erwartet, dass diese Stämme solche Zustände gebessert hätten. Der Grund dafür, dass M. elsdenii bei der Senkung der Laktatkonzentration nicht wirksam war, könnte in der Schwierigkeit der M. elsdenii-Population liegen, sich in der Pansenflüssigkeit zu etablieren, wie in vivo berichtet wurde22. Frühere Studien berichteten, dass sich M. elsdenii möglicherweise aufgrund der Wirtsspezifität möglicherweise nicht gut im Pansen etablieren, selbst wenn sie aus dem Pansen isoliert wurden23. Da die aktuelle Studie in vitro durchgeführt wurde, könnte das Mikrobiom in der Zeit vor der Exposition eine Dynamik entwickelt haben, die gegen Veränderungen resistent war. Darüber hinaus kann die Konkurrenz um Substrate mit der einheimischen Mikrobiota die Überlebenswahrscheinlichkeit von M. elsdenii und S. cerevisiae verringern, da sie mit anderen Bakteriengruppen um Substrate konkurrieren24. Die ursprüngliche Mikrobenpopulation hat möglicherweise die Verbreitung anderer Populationen wie der getesteten DFM verhindert. Ein weiterer Faktor für die mangelnde Etablierung der M. elsdenii-Population könnte die Häufigkeit der Dosierung der Fermenter gewesen sein. Bei Weimer et al.22 wurden unterschiedliche Dosierungszeiten getestet, und selbst wenn M. elsdenii-Stämme viermal in 5 Tagen dosiert wurden, kehrten die M. elsdenii-Stämme nach der Infusion schnell zu ihrer ursprünglichen niedrigen Pansenkonzentration zurück. Um dieses Problem zu vermeiden, wurde in unserer Studie das DFM zweimal täglich verabreicht, was möglicherweise immer noch nicht ideal war. Schließlich ist es wichtig zu erkennen, dass auch andere Mikroorganismen die Pansenmilchsäure im Pansen metabolisieren können und dass der Beitrag von M. elsdenii und S. cerevisiae zu ihrem Metabolismus bei akuter Pansenazidose möglicherweise überschätzt wurde2,3,21.

In der Studie gab es einen konsistenten Einfluss des Tages; Die meisten akuten azidotischen Zustände traten bereits einen Tag nach Beginn der Belastung auf [Tage 1 und 2 relativ zur Belastung (Abb. 1)]. Die Entstehung azidotischer Bedingungen einen Tag nach der Ernährungsumstellung kann mehrere Gründe haben: Erstens besteht einer der Vorteile des kontinuierlichen Dual-Flow-Kultursystems darin, dass es die Flüssigkeits- und Partikelflussraten aus dem Fermenter präzise reguliert (z. B. Pansenmodell). Wir haben diese Durchflussraten auf der Grundlage der gemeldeten Pansenverdünnungsraten von Mastrindern ausgewählt. Obwohl das System die Digesta-Flussraten präzise reguliert, um die in vivo-Bedingungen basierend auf bestimmten Tiermodellen nachzuahmen, minimiert eine solche präzise Regulierung auch die Auswirkungen einzelner Tiere, die solchen Herausforderungen schneller oder langsamer ausgesetzt sein könnten. Der Vorteil besteht darin, dass wir durch die Kontrolle der Futteraufnahme und der Digesta-Flussraten in der Lage sind, die Pansenfunktion zu isolieren, was unser Hauptziel war und in vivo nicht möglich ist. Daher kann die Reaktion auf die Behandlungen, wie in einem In-vivo-Modell, aufgrund von Änderungen in der Futteraufnahme, den Verdauungsflussraten, der Umwelt und anderen Faktoren unterschiedlich sein. Hier konnten wir diese Behandlungen in einem Szenario mit akuter Pansenazidose isolieren und eindeutig testen . Der zweite Grund betrifft den Verdünnungseffekt durch das Vorhandensein von NDF-Rückständen in den Fermentationsrückständen aus der nicht-azidotischen Ernährung (Tabelle 1). Obwohl NDF über die Nahrung mit einer größeren Kauaktivität und Pufferkapazität des Pansens verbunden ist19,25,26, verfügte das in dieser Studie verwendete System über eine kontinuierliche Infusion von künstlichem Speichel während des gesamten Experiments. Daher könnten diese Bedingungen dazu beigetragen haben, dass am ersten Tag der Herausforderung immer noch eine Matte vorhanden war. Diese Matte fungiert als Mikroumgebung mit erhöhtem pH-Wert, die den Abbau struktureller Kohlenhydrate optimieren kann25. Die Matte war am Tag 0 sichtbar, fehlte jedoch an den Tagen 1 und 2 im Vergleich zur Belastung (siehe ergänzende Abbildungen 1 und 2).

Eine weitere mögliche Erklärung für die Entstehung azidotischer Zustände am Tag nach der Ernährungsumstellung ist der Zeitpunkt, zu dem der Höhepunkt der Gesamtlaktatkonzentration erreicht wurde. Dieser wurde trotz des geringen Unterschieds zwischen den Belastungstagen hauptsächlich am ersten Tag im Vergleich zur Belastung beobachtet, nicht jedoch Tag 0 (Abb. 2). Basierend auf früherer Literatur wird erwartet, dass sich Bakterien, die nichtstrukturelle Kohlenhydrate zu Milchsäure fermentieren (z. B. Milchsäure produzierende Bakterien), während einer Pansenazidose unter günstigen Bedingungen schnell vermehren27,28. Andererseits wird erwartet, dass Bakterien, die Laktat zu anderen VFA wie Propionsäure vergären (z. B. Milchsäure verwertende Bakterien), im Pansen eine längere Verdoppelungszeit haben27,29; Dieser Mangel an Synchronisation zwischen diesen Bakteriengruppen führt zur Ansammlung von Laktat (stärkere Säure, wenn es nicht dissoziiert ist) und in der Folge zu einem pH-Abfall2. Es besteht die Möglichkeit, dass sich Bakterien an das erhöhte Substrat anpassen müssen, um ihren Stoffwechsel hochzuregulieren und eine messbare Verschiebung herbeizuführen, was die Verzögerung bei der Etablierung solcher Bedingungen erklären könnte. Darüber hinaus deuten die aktuellen Ergebnisse darauf hin, dass trotz eines möglichen Anstiegs der Milchsäure produzierenden Bakterien während der Fermentation die Gesamt-VFA-Konzentration (Abb. 3) über die Testtage hinweg gesenkt wurde, was auf einen größeren Mangel an Synchronität zwischen den Bakteriengruppen mit fortschreitender Challenge hindeutet.

Dynamik von D-Lactat, L-Lactat und Gesamtlactatkonzentration nach der morgendlichen Fütterung an den Tagen 8, 9, 10 und 11 jeder Periode, um die Tage − 1, 0, 1 und 2 im Verhältnis zur Belastung darzustellen; Tag 7 wurde als Kovariate für das Modell verwendet. Alle Behandlungen hatten die gleiche Grundnahrung (1 ml jedes DFM wurde pro Tag mit 1 × 108 KBE/ml angewendet); Behandlungen waren: Kontrolle, Träger von Zusatzstoffen ohne DFM; YM1, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 1; YM1, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 2; YMM, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 1 (1/2 Dosis) und Stamm 2 (1/2 Dosis). Statistische Unterschiede wurden bei P ≤ 0,05 oder als unterschiedlicher Trend angegeben, wenn P > 0,05 und < 0,10.

Dynamik der Konzentration flüchtiger Fettsäuren (VFA) nach der morgendlichen Fütterung an den Tagen 8, 9, 10 und 11 jeder Periode, um die Tage − 1, 0, 1 und 2 im Verhältnis zur Belastung darzustellen; Tag 7 wurde als Kovariate für das Modell verwendet. Alle Behandlungen hatten die gleiche Grundnahrung (1 ml jedes DFM wurde pro Tag mit 1 × 108 KBE/ml angewendet); Behandlungen waren: Kontrolle, Träger von Zusatzstoffen ohne DFM; YM1, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 1; YM1, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 2; YMM, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 1 (1/2 Dosis) und Stamm 2 (1/2 Dosis). Statistische Unterschiede wurden bei P ≤ 0,05 oder als unterschiedlicher Trend angegeben, wenn P > 0,05 und < 0,10.

Da das kontinuierliche Dual-Flow-Kultursystem die Endprodukte der Fermentation mit der gleichen Geschwindigkeit entfernt, ist interessanterweise zu erwarten, dass die Konzentration der Endprodukte der Fermentation der Produktion dieser Endprodukte ähnelt. Daher ermöglicht dieses System ein besseres Verständnis der Produktion von Milchsäureisomeren unter azidotischen Bedingungen, die bei L-Milchsäure vermutlich größer ist als bei D-Milchsäure30. Während des Höhepunkts der Milchsäureproduktion (Tag 1 relativ zur Belastung) wies die Kontrollbehandlung eine höhere L-Lactat-Konzentration als D-Lactat-Konzentration auf (Abb. 2). Allerdings zeigten die DFM-haltigen Behandlungen das entgegengesetzte Muster und die D-Lactat-Konzentration war höher als die L-Lactat-Konzentration. Obwohl keine Wechselwirkung oder Behandlungswirkung auf die Laktatkonzentration beobachtet wurde, deuten die Daten darauf hin, dass die Behandlungen, die DFM enthielten, im Vergleich zur Kontrolle eine größere und längere Milchsäureproduktion aufwiesen, was hauptsächlich auf die höhere D-Milchsäureproduktion zurückzuführen war. Laut Harmon et al.31 kann L-Milchsäure im Pansen eine höhere Absorptionsrate aufweisen als D-Milchsäure, was darauf hindeutet, dass sich letztere ansammeln und den pH-Wert in vivo negativ beeinflussen kann, wenn sich ihre Anteile während der Fermentation umkehren Einstellung. Es ist wichtig zu beachten; Obwohl Milchsäure ein wichtiger Bestandteil ist, der den pH-Wert im Pansen beeinflusst, insbesondere bei Pansenazidose-Erkrankungen2,21, und im Vergleich zu anderen VFA im Pansen eine stärkere Säure ist (pKa von Milchsäure = 3,9 vs. VFA im Pansen = 4,9), haben wir jedoch einen größeren Wert erwartet Konzentration dieses Metaboliten in unserer Studie. Die insgesamt niedrige Milchsäurekonzentration, die wir in diesem System gefunden haben und die andere Faktoren wie Futteraufnahme, Verdauungsflussraten, Speichelvolumen, Schwankungen in der Harnstoffrecyclingrate und andere isoliert, lässt daher darauf schließen, dass Milchsäure einen solchen Beitrag zur akuten Pansenazidose leisten könnte wurden in früheren In-vivo-Studien überschätzt und erfordern weitere Forschung.

Trotz fehlender Behandlungseffekte auf die Milchsäurekonzentration war die endgültige Essigsäurekonzentration bei der Kontrolle höher als bei den DFM-Behandlungen, während bei der Propionsäurekonzentration das Gegenteil der Fall war (Tabelle 2). Das Verhältnis von Essigsäure zu Propionsäure wurde auch durch den DFM-Einschluss beeinflusst, wobei die Kontrolle im Vergleich zu den anderen Behandlungen das größte Verhältnis aufwies. Tatsächlich hatten die Behandlungen der aktuellen Studie das Ziel, Laktat zu VFA, insbesondere Propionsäure, umzuwandeln10,32. Wir gehen jedoch davon aus, dass diese Behandlungen nur einen geringen Effekt auf die Reduzierung der Milchsäurekonzentration und die Produktion von Propionsäure hatten, da keine Auswirkungen der Behandlung auf die Laktatkonzentrationen beobachtet wurden (Abb. 2) und während der Schnappschusssammlungen geringfügige Auswirkungen auf die Essig- und Propionsäurekonzentrationen beobachtet wurden während der Herausforderung (Abb. 3).

Ein weiteres einzigartiges Merkmal, das in Dual-Flow-Fermentern für kontinuierliche Kultur untersucht werden kann, ist die Möglichkeit, den Effekt des Harnstoffrecyclings von der NH3-N-Konzentration im Pansen zu isolieren. Das Harnstoffrecycling wurde in diesem System durch eine konstante Harnstoffinfusionsrate mit dem künstlichen Speichel simuliert; Daher waren Änderungen der NH3-N-Konzentration während der Fermentation nicht auf Änderungen in der Harnstoffrecyclingrate zurückzuführen. Hierbei wurde eine Verschiebung der NH3-N-Konzentration beobachtet, wenn die Ernährung umgestellt wurde: von 5 bis 10 mg/dl bei der nicht-azidotischen Diät, auf 3 bis 8 mg/dl am Tag 0 und später im Bereich von 1 bis 3 mg/dl. dL, nachdem sich azidotische Bedingungen etabliert hatten (Tage 1 und 2; Abb. 4). Laut Satter und Slyter33 sind mindestens 2 mg NH3–N/dL erforderlich, damit die mikrobielle Fermentation ablaufen kann. Ammoniak-N-Konzentrationen unterhalb der normalen Fermentationsbedingungen können die Proteinsynthese und das Wachstum einiger Mikroorganismen (z. B. fibrolytischer Bakterien) verringern33. Obwohl die Effizienz der N-Verwertung durch Pansenmikroorganismen in der Studie hoch war (> 80 %; Tabelle 3), könnten einige Mikroorganismen wie Milchsäure produzierende Bakterien (LAB), die unter Bedingungen mit niedrigem pH-Wert gedeihen2, eine höhere Effizienz bei der Nutzung von NH3–N aufweisen für die Proteinsynthese. Da Mikroorganismen, deren Wachstum unter solchen Bedingungen beeinträchtigt sein kann, im Vergleich zu Milchsäure aus LAB-Bakterien schwächere VFA (z. B. Essig- und Buttersäure) produzieren, wäre eine Erhöhung der Harnstoffrecyclingrate von grundlegender Bedeutung, um das Wachstum der ehemaligen Mikrobenpopulationen aufrechtzuerhalten . In einer In-vivo-Umgebung würde die niedrige NH3-N-Konzentration im Pansen theoretisch durch eine Steigerung des Harnstoffrecyclings über Speichel und Blut ausgeglichen34,35. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bestimmte Tiervariationen, die den schnellen Anstieg des Harnstoffrecyclings auslösen, ein höheres Risiko für eine akute Pansenazidose darstellen könnten; ein Zustand, der einer weiteren Bewertung wert sein könnte.

Dynamik der NH3-N-Konzentration nach der morgendlichen Fütterung an den Tagen 8, 9, 10 und 11 jeder Periode, um die Tage − 1, 0, 1 und 2 im Verhältnis zur Belastung darzustellen; Tag 7 wurde als Kovariate für das Modell verwendet. Alle Behandlungen hatten die gleiche Grundnahrung (1 ml jedes DFM wurde pro Tag mit 1 × 108 KBE/ml angewendet); Behandlungen waren: Kontrolle, Träger von Zusatzstoffen ohne DFM; YM1, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 1; YM1, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 2; YMM, S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 1 (1/2 Dosis) und Stamm 2 (1/2 Dosis). Statistische Unterschiede wurden bei P ≤ 0,05 oder als unterschiedlicher Trend angegeben, wenn P > 0,05 und < 0,10.

In ähnlicher Weise könnte die geringe N-Verfügbarkeit während des Belastungszeitraums das Muster der Substratnutzung durch M. elsdenii verändert haben12,21,22. Obwohl M. elsdenii Milchsäure schneller fermentiert als Glukose, wurde berichtet, dass dieses Bakterium bei Glukose eine höhere Wachstumsausbeute aufweist als bei Milchsäure12. In Kombination mit der geringen N-Verfügbarkeit könnte es in der aktuellen Studie auch zu einer Änderung des Fermentationsmusters des Substrats gekommen sein, wodurch die Wirksamkeit von M. elsdenii bei der Linderung von Azidose und der Reduzierung der undissoziierten Milchsäurebelastung während der Fermentation verringert wurde.

Während der Herausforderung wurde auch der Nährstoffabfluss aus der Fermentation gemessen, um herauszufinden, ob DFM die Nährstoffverdaulichkeit verbessern würde. Der Nährstoffabfluss ist in Tabelle 1 aufgeführt. Es wurden keine Wechselwirkungen oder Behandlungseffekte beobachtet. Mit Ausnahme des Stärkeausflusses hatten alle anderen Nährstoffe einen Tageseffekt (Daten nicht gezeigt), möglicherweise aufgrund von Rückständen der nicht-azidotischen Diät, die in den ersten Stunden des Belastungstages vorhanden waren. Das Fehlen eines Tageseffekts für den Stärkefluss wurde erwartet, da erwartet wird, dass nichtfaserige Kohlenhydrate im Pansen schnell abgebaut werden1,2. Bei DM, OM und CP war der Abfluss am Tag 0 am größten, während der Abfluss bei NDF und ADF während der Challenge-Tage kontinuierlich abnahm. Der Abfluss von mikrobiellem DM, OM, CP und Glykogen war an den Tagen 1 und 2 höher als am Tag 0, möglicherweise aufgrund einer höheren Effizienz der N-Verwertung, da leichter fermentierbare Kohlenhydrate verfügbar waren. Es gab ein Muster einer abnehmenden CP-Verdaulichkeit, wenn die YMM-Behandlung verwendet wurde, was sich in einem größeren echten CP und geringeren mikrobiellen OM- und CP-Ausflüssen aus der Fermentation (Tabelle 1) sowie einer Abnahme der mikrobiellen Effizienz (Tabelle 3) zeigte. Über die Wirkung milchsäureverwertender Bakterien auf den N-Stoffwechsel im Pansen gibt es kaum Literatur. Da diese neuen M. elsdenii-Stämme jedoch aufgrund der jüngsten Extraktion und Kultivierung aus einem sauren Pansen noch nicht weiter untersucht wurden, ist eine mögliche Erklärung die Konkurrenz dieser Stämme um Substrate, die von anderen Bakteriengruppen genutzt werden24. Diese neuen Stämme könnten mit anderen Bakteriengruppen um Protein konkurriert haben; Dies erklärt möglicherweise den verringerten Proteinabbau bei dieser Behandlung. Darüber hinaus vermittelt eine Behandlung ohne Hefe (oder nur Hefe) ein klareres Bild der spezifischen Wirkungen von M. elsdenii allein oder sogar der Art und Weise, wie sie sich gegenseitig ergänzen. Aufgrund der Einschränkungen der aktuellen Studie wurde dies jedoch nicht bewertet und es sind weitere Untersuchungen erforderlich.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es dieser Studie gelungen ist, in vitro eine akute Pansenazidose auszulösen, was sich in der Abnahme des Fermentations-pH-Werts unter 5,2 über einen längeren Zeitraum in Dual-Flow-Fermentern für kontinuierliche Kultur zeigt. Darüber hinaus konnten wir durch die Isolierung von Faktoren, die aufgrund individueller Tiervariationen in vivo nicht isoliert werden können, den Beginn einer akuten Pansenazidose klarer beurteilen und potenzielle Wissenslücken aufzeigen, die in vivo weniger wahrscheinlich beobachtet werden. Die DFM-Behandlungen hatten im Vergleich zur Kontrolle ein anderes Muster der Milchsäureproduktion; Während der Fermentation wurde mehr D-Milchsäure als L-Milchsäure produziert. Die Behandlungen führten zu einem leichten Anstieg der Propionsäure während der Belastung, es wurde jedoch keine Verringerung der Laktatkonzentration beobachtet. Da die Milchsäurekonzentration geringer war als von uns in der aktuellen Studie erwartet, deuten die Daten darauf hin, dass andere Faktoren als Milchsäure beim Ausbruch einer akuten Pansenazidose von größerer Bedeutung sein könnten als bisher berichtet. Dieses In-vitro-System ermöglichte die Beobachtung einer verringerten NH3-N-Konzentration, die nahezu einem Mangel entsprach; Eine Situation, die in vivo aufgrund der Stimulation des Harnstoffrecyclings möglicherweise nicht immer beobachtet wird und mit großer Wahrscheinlichkeit Teil des Ausbruchs einer akuten Pansenazidose ist. Schließlich reduzierte die YMM-Mischung, die alle als DFM verwendeten Mikroorganismen enthielt, trotz des Fehlens größerer Auswirkungen des in unserer Studie getesteten DFM den Proteinabbau und war gleichzeitig die einzige Behandlung, die die Herausforderung bis zum letzten Tag der Fermentation bewältigte. Die in dieser Studie berichteten Ergebnisse zur Bedeutung von N bei akuter Pansenazidose verdeutlichen noch einmal andere wichtige Faktoren neben Milchsäure, die möglicherweise in zukünftigen Forschungsarbeiten zur Linderung dieser relevanten Ernährungsstörung in der Rind- und Milchviehindustrie berücksichtigt werden müssen.

Alle experimentellen Verfahren mit den Tieren, die in der Studie als Pansenflüssigkeitsspender eingesetzt wurden, wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Florida (IACUC #202009849) genehmigt wurden. Darüber hinaus wurden alle Methoden gemäß den IACUC-Richtlinien und -Vorschriften durchgeführt. Die folgende Studie wird gemäß den ARRIVE-Richtlinien berichtet.

In der Studie wurden acht kontinuierliche Dual-Flow-Kulturfermenter (1820 ml) verwendet, die denen von Hoover et al.36 ähneln und von Del Bianco Benedeti et al.37, Silva et al.38 und Paula et al.39 modifiziert wurden simulieren die Pansengärung. Jeder der Fermenter wurde als Versuchseinheit betrachtet und in einem nachgebildeten 4 × 4 lateinischen Quadratdesign angeordnet. Es gab 4 Versuchsperioden, die jeweils aus 11 Fermentationstagen bestanden. Akute Pansenazidose-Bedingungen wurden in den Fermentern erzeugt, indem ihnen vom 1. bis 8. Tag eine Diät verabreicht wurde, die keine akute Pansenazidose verursachte (nichtazidotische Diät), und vom 9. bis 11. Tag, indem den Fermentern eine getreidereiche Diät verabreicht wurde (Challenge). Diät) zur Förderung azidotischer Zustände. Beide Futtermittel wurden ähnlich denen von Mastvieh-Ochsen formuliert19 und sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Einen Tag vor der Umstellung der Ernährung (Tag 8) wurden die experimentellen Behandlungen (direkt gefütterte Mikroben) während der morgendlichen Fütterungszeit und jeder Fütterungszeit danach bis zum 11. Tag in die Fermenter infundiert. Bei den Behandlungen handelte es sich um eine Kontrolle, die nur den verwendeten Träger enthielt bei allen Behandlungen (wässrige Lösung mit 15 % Glycerin); YM1, der Träger plus S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 1; YM2, der Träger plus S. cerevisiae und M. elsdenii Stamm 2; und YMM, der Träger plus S. cerevisiae und die Hälfte der Dosen von M. elsdenii Stamm 1 und Stamm 2. Jede DFM-Dosis hatte eine Konzentration von 1 × 108 KBE/ml. Alle Behandlungen und ihre Zusammensetzung sind in Tabelle 5 dargestellt.

Die während des gesamten Experiments verwendeten Nahrungsbestandteile wurden aus derselben Futtercharge gewonnen und später am selben Tag gemahlen. Die Zutaten wurden mit einer Wiley-Mühle (Arthur H. Thomas Co., Philadelphia, PA) so gemahlen, dass sie ein 2-mm-Sieb passierten, und eine Teilprobe von 500 g von jedem der Zutaten wurde für chemische Analysen so gemahlen, dass sie ein 1-mm-Sieb passierte . Alle Nahrungsbestandteile wurden ordnungsgemäß in einer temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Umgebung gelagert. Für jeden Fütterungszeitpunkt wurden die Futtermittel individuell für jeden Fermenter zubereitet, indem die Nahrungsbestandteile separat abgewogen und in versiegelten Plastiktüten (14 × 8 cm) aufbewahrt wurden.

Als Spender des Panseninhalts wurden drei Black-Angus-Ochsen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 630 kg verwendet, die mit permanenten 10-cm-Pansenkanülen ausgestattet waren (Bar Diamond, Inc., Parma, ID). Die Tiere wurden von 2 Wochen vor der ersten Entnahme bis zum Ende der Studie mit der gleichen nicht-azidotischen Diät gehalten, die den Fermentern zugeführt wurde. Am Inokulationstag wurde der Panseninhalt von allen drei kanülierten Ochsen 2 Stunden nach der Morgenfütterung aus den vorderen, hinteren, kaudalen und ventralen Bereichen des Pansens gesammelt. Der Panseninhalt wurde durch 4 Schichten Käsetuch in vorgewärmte, isolierte Gefäße gesiebt und ins Labor gebracht (ca. 5 Minuten entfernt). Im Labor wurde der Panseninhalt aller Tiere gleichmäßig homogenisiert, bevor er in die Fermenter geimpft wurde. Anschließend wurde der Panseninhalt bis zur Auslaufgrenze in die vorgewärmten Fermenter gefüllt. Die Fermentationsbedingungen wurden aufrechterhalten, indem die Fermenter auf eine Rührgeschwindigkeit von 100 U/min, eine Temperatur von 39 °C und eine N2-Infusion in den Fermentationsinhalt und in den Kopfraum der Fermenter von 200 ml N2/min eingestellt wurden.

Unabhängig von der Diät wurden den Fermentern 107 g TM pro Tag zu gleichen Teilen auf zwei Mahlzeiten (7:00 und 21:00 Uhr) verabreicht. Künstlicher Speichel wurde nach Weller und Pilgrim40 hergestellt und als Puffer für die Pansenfermentation kontinuierlich in die Fermenter infundiert. Um das Harnstoffrecycling im Pansen zu simulieren, wurde dem künstlichen Speichel Harnstoff in einer Menge von 0,4 g/L zugesetzt. Da das kontinuierliche Dual-Flow-Kultursystem es ermöglicht, die Passageraten des Panseninhalts aus den Fermentern vorab festzulegen, wurde die Verdünnungsrate auf eine Rate von 10 %/h eingestellt, während die Passagerate der Feststoffe auf eine Rate von 5 eingestellt wurde %/H; Alle basieren auf dem Volumen des Fermenters und ähneln denen, die bei der Endbearbeitung von Ochsen beobachtet werden. Diese Raten wurden durch zwei Mechanismen angepasst: (1) die kontinuierliche Infusion von künstlichem Speichel durch eine peristaltische Pumpe (flüssiger Anteil) zusammen mit der Nahrung (fester Anteil) in die Fermenter; und (2) die kontinuierliche Ausgabe des Fermentationsinhalts durch zwei Anschlüsse, wobei der erste die Entfernung der gefilterten Fermentationsflüssigkeit (500 µm Drahtgeflecht) aus den Fermentern mit einer Rate von 5 %/h des Fermentervolumens durch eine andere peristaltische Pumpe ist, und der zweite ist der kontinuierliche Abfluss des Fermentationsinhalts durch die Schwerkraft aus der Differenz zwischen Mechanismus 1 und der Entfernung der gefilterten Fermentationsflüssigkeit aus dem Fermenter. Der Inhalt beider Ausgangsanschlüsse jedes Fermenters wurde in zwei getrennten 4,3-l-Kunststoffbehältern gesammelt.

Während des gesamten Experiments wurde der pH-Wert der Fermentation 14 Stunden lang jede Stunde manuell gemessen, um einen vollständigen Fermentationstag darzustellen, beginnend kurz vor der morgendlichen Fütterungszeit (07:00 Uhr) und endend kurz vor der nächtlichen Fütterungszeit (21:00 Uhr). Die Fütterungszeiten wurden unter Berücksichtigung eines Intervalls von 14 Stunden am Tag (07:00 bis 21:00 Uhr) und 10 Stunden in der Nacht (21:00 bis 07:00 Uhr) ermittelt, damit der niedrigste pH-Wert eines ganzen Tages 3–4 Stunden nach dem Morgen erreicht wird Fütterungszeit (basierend auf einem Vorversuch, den wir vor der Studie durchgeführt haben). Diese pH-Messungen wurden mit einem tragbaren pH-Meter (Thermo Scientific Orion Star A121) über eine Öffnung im Kopfraum der Fermenter durchgeführt. Außer an Probenahmetagen wurde der Abwasserinhalt in den Plastikbehältern täglich kurz vor der morgendlichen Fütterungszeit gewogen und entsorgt.

Unmittelbar vor der morgendlichen Fütterungszeit am Tag 5 jedes Zeitraums wurden die Abwasserbehälter aus jedem Fermenter gemischt und eine Probe von 500 g für die Analyse der natürlichen 15N-Häufigkeit entnommen; Dieses Beispiel wurde als Hintergrund bezeichnet. Anschließend wurden die Fermenter mit 15N als Marker für die mikrobielle Proteinsynthese angereichert, indem zunächst die 15N-Konzentration in den Fermentern auf einen stabilen Zustand gebracht und später die 15N-Infusion dort konstant gehalten wurde40. Daher wurde vor der morgendlichen Fütterung am Tag 5 eine Impulsdosis von 10,2 % Überschuss an (15NH4)2SO4 in die Fermenter infundiert und Harnstoff im künstlichen Speichel teilweise durch eine isostickstoffhaltige Menge an (15NH4)2SO4 ersetzt (Sigma-Aldrich). Co., St. Louis, MO); Dieser mit 15N markierte künstliche Speichel wurde vom 5. Tag bis zum Ende jedes Versuchszeitraums verwendet.

Am 6. Tag und während der gesamten Sammelperiode wurden die Abwasserbehälter in einem gekühlten Wasserbad (< 4 °C) gehalten, um die mikrobielle Aktivität des Abwasserinhalts zu stoppen, wann immer dieser die Fermenter verließ. Am siebten Tag wurde unter der nicht-azidotischen Diät und einen Tag vor der Anwendung der Behandlungen der pH-Wert stündlich zwischen der morgendlichen und abendlichen Fütterungszeit (14 Stunden) gemessen und zwei Proben (10 und 2 ml) aus dem Inneren entnommen die Fermenter direkt vor der morgendlichen Fütterung und 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11 und 14 Stunden nach der Fütterung für NH3-N-, VFA- und Laktatkonzentrationsanalysen in den Fermentern. Die Probe für NH3–N und VFA (10 ml) wurde gesammelt, indem der Fermentationsinhalt in 4 Lagen Käsetuch filtriert und die Flüssigkeit sofort in 0,1 % einer 50 %igen H2SO4-Lösung angesäuert wurde. Die Laktatprobe (2 ml) wurde, obwohl nicht angesäuert, ebenfalls durch Filtern des Fermentationsinhalts in 4 Lagen Käsetuch gesammelt; Beide Proben wurden zur weiteren Analyse bei –20 °C gelagert. Diese Stichproben wurden später in den statistischen Analysen als Kovariate für ihre jeweiligen Variablen verwendet.

Vom 8. bis zum 11. Tag wurden die Behandlungen dann zu jeder Fütterungszeit angewendet. Die Behandlungen wurden nach Fütterungszeiten getrennt in Fläschchen mit Schraubverschluss aufbewahrt und bis zur Verwendung jedes Fläschchens in einem Gefrierschrank bei –80 °C gelagert. Fünfzehn Minuten vor jeder Fütterungszeit wurden die für die jeweilige Zeit zu verwendenden Fläschchen in warmem Wasser aufgetaut und die Kultur jedes Fläschchens wurde fünfmal mit einer sterilen Pipettenspitze resuspendiert. Anschließend wurde jede Behandlung gemäß den in Tabelle 5 angegebenen Dosen zusammen mit der Diät auf die jeweiligen Fermenter angewendet. Für Tag 8 wurden die gleichen Messungen von pH, NH3–N, VFA und Laktat durchgeführt, und die Daten wurden als Überblick über das Fermentationsmuster für die Fermenter während der nicht-azidotischen Diät (Basislinie) verwendet.

Ab dem 9.–11. Tag wurde schließlich die nicht-azidotische Diät durch die Provokationsdiät ersetzt und den Fermentern während der jeweiligen Behandlung zugeführt. Derselbe Probenahmeplan an den Tagen 7 und 8 für pH, NH3–N, VFA und Laktat wurde durchgeführt, um sowohl das Szenario einer akuten Pansenazidose als auch die Fermentationsreaktion auf die Behandlungen zu bewerten. Mit dem Ziel zu bewerten, wie sich die Behandlungen auf den Pansen-N-Stoffwechsel und die tatsächliche Verdaulichkeit von Nährstoffen nach einem ganzen Fermentationstag auswirken könnten, wurde eine Probe von 500 g aus dem Abwasser jedes Fermenters (Mischung aus beiden Behältern) entnommen und bei –20 °C gelagert °C zur weiteren Analyse. In ähnlicher Weise wurde eine Probe von 10 ml nach der gleichen Probenvorbereitung wie zuvor für NH3–N und VFA entnommen, um den endgültigen täglichen NH3–N-Abfluss und die VFA-Konzentration, die einen Fermentationstag darstellt, weiter zu untersuchen. Diese Sammlungen wurden aus den Abwässern vor der Fütterungszeit am nächsten Morgen durchgeführt, um einen vollständigen Versuchstag zu berücksichtigen.

Am Ende des letzten Tages jedes Versuchszeitraums wurde der gesamte Inhalt jedes Fermenters zur Bakterienisolierung gemäß den von Krizsan et al.41 und Brandão et al.42 beschriebenen Verfahren verwendet. Kurz gesagt, der Inhalt wurde 30 Sekunden lang mit einer 200 ml NaCl-Lösung vermischt, dann durch 4 Lagen Käsetuch filtriert und die zurückgehaltenen Feststoffe mit weiteren 200 ml der NaCl-Lösung gespült. Der gefilterte Inhalt wurde dann dreimal bei 4 °C zentrifugiert, bis ein sauberes Bakterienpellet erhalten wurde. Das Pellet wurde zur weiteren Analyse ebenfalls bei –20 °C gelagert.

Die Proben für die NH3-N- und VFA-Analyse wurden 15 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 × g zentrifugiert. Eine Teilprobe des Überstands wurde zur Bestimmung von NH3–N verwendet. Die NH3-N-Analyse wurde nach Broderick und Kang43 mit einer Anpassung für Plattenlesegeräte44 durchgeführt. Der verbleibende Überstand wurde erneut 15 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 × g zentrifugiert, wobei der neuere Überstand zur VFA-Analyse durch einen Celluloseacetat-Spritzenfilter (SF14485, Tisch Scientific®) filtriert wurde. Die Konzentration von VFA wurde mit einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC; Hitachi L2400, Tokio, Japan)45 analysiert.

Die nicht angesäuerten Proben wurden 10 Minuten lang bei 100 °C gekocht, um Enzyme zu denaturieren und VFA aus der Probe zu verflüchtigen. Anschließend wurden die Proben 15 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 × g zentrifugiert und der Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das zur Bestimmung der d-Lactat-, l-Lactat- und Gesamtlactatkonzentrationen verwendet wurde. Die Laktatkonzentrationen wurden durch enzymatische Reaktionen mit einem R-Biopharm-Kit46 analysiert. Kurz gesagt handelte es sich um eine enzymatische Methode, die in zwei Schritte unterteilt war und zur Bestimmung der d- bzw. l-Lactat-Konzentration verwendet wurde. Die Laktatkonzentration wurde mithilfe der Enzyme d- und l-Laktatdehydrogenase bestimmt und die Gesamtlaktatkonzentration aus der Summe beider Laktatkonzentrationen berechnet.

Der Abwasserinhalt und die Bakterienpellets wurden mit einem Labconco FreeZone 6 (Labconco Corporation, Kansas City, MO, USA) gefriergetrocknet. Die Nahrungsbestandteile, der Hintergrund, der Abwassergehalt und die Bakterienpellets wurden auf DM (Methode 934.01; AOAC, 1990), Asche (Methode 924.05)47 und auf Gesamt-N- und 15N-Anreicherung analysiert [CHNS-Analysator gekoppelt mit einem Isotopenverhältnis-Massenspektrometer ( Trockenverbrennungsverfahren nach Dumas)48. Der OM wurde als Differenz zwischen TS- und Aschegehalt betrachtet. Die CP-Konzentration wurde aus dem Gesamt-N-Gehalt berechnet (Gesamt-N × 6,25; TS-Basis). Nahrungsbestandteile, Abwasserinhalte und Bakterienpellets wurden mithilfe einer enzymatisch-kolorimetrischen Methode49 auf Gesamtglukose analysiert, mit dem Ziel, den Stärkegehalt von Nahrungsnährstoffen und Abwasserinhalten sowie die Glykogenkonzentration in Bakterienzellen zu bestimmen. Nahrungsinhaltsstoffe und Abwasserinhalte wurden auf NDF25 und anschließend auf ADF50 analysiert, beide mit einer Adaption für den Ankom200 Fiber Analyzer (Ankom Technology, Macedon, NY). Nahrungsbestandteile wurden auch auf Etherextrakt (EE; Methode 920.85) analysiert51. Der Gehalt an insgesamt verdaulichen Nährstoffen (TDN) wurde anhand der folgenden Gleichungen berechnet:

Mithilfe der pH-Daten des Pansens wurde die Zeit berechnet, in der der pH-Wert zwischen den Fütterungszeiten innerhalb bestimmter Schwellenwerte lag [Zeit bei subakuter Pansenazidose (SARA; Zeit, in der der pH-Wert zwischen 5,2 und 5,6 lag); und Zeit, in der der pH-Wert unter 5,2 lag (Indikator für akute Pansenazidose)]. Um dann die größten pH-Unterschiede zu quantifizieren, wurde die Fläche unter der pH-Kurve (Fläche unter der Kurve; AUC) für die oben genannten Schwellenwerte unter Verwendung der Trapezregel20,52 wie folgt berechnet:

wobei pH0 und pH1 zwei pH-Messungen in einem pH-Intervall t0 bzw. t1 sind.

Da an den Tagen 9–11 noch Nährstoffrückstände aus der nicht-azidotischen Ernährung (Tage 1–8) vorhanden waren, berichteten wir im Hinblick auf die Nährstoffverdaulichkeit über einen tatsächlichen Nährstofffluss aus den Fermentern, d. h. umso höher war der Nährstoffflusswert weniger verdaut wäre es gewesen. Der tatsächliche Nahrungsnährstofffluss wurde als der Gesamtnährstoff berechnet, der den Fermenter verließ, korrigiert um die Konzentration dieses Nährstoffs in den Bakterien und im künstlichen Speichel. Der gesamte N-Gehalt im Abwasser wurde in NH3-N und Nichtammoniak-N (NAN; nicht abgebauter Futter-N und Bakterien-N) aufgeteilt. Der Abfluss jeder dieser Fraktionen aus der Fermentation wurde nach den von Calsamiglia et al.53 und Bach und Stern54 beschriebenen Gleichungen berechnet. Der N-Fluss über die Nahrung, die bakterielle Effizienz und die Effizienz der N-Nutzung (ENU) wurden nach Calsamiglia et al.53 berechnet. Die Berechnungen waren wie folgt:

Die Daten wurden unter Verwendung des MIXED-Verfahrens von SAS als repliziertes 4 × 4-Latin-Square-Design analysiert. Das für unsere Datenanalysen verwendete Hauptmodell war das folgende:

Dabei ist Yijkl die Antwortvariable, µ der Gesamtmittelwert, Li der Effekt des lateinischen Quadrats (i = 1 oder 2), Pj der Zufallseffekt der Periode (j = 1–4), F(S)ki der Zufall Wirkung des Fermenters (F) innerhalb des Quadrats (k = 1–4), TRl ist die Wirkung der Behandlung, Dm ist die Wirkung des Tages, T × Dlm ist die Wechselwirkung zwischen Behandlung und Tag und Eijkl ist der Restfehler.

Flüchtige Fettsäuren und pH-bezogene Variablen, die aus der Dynamik des pH-Werts berechnet wurden, wie z. B. der durchschnittliche pH-Wert, Stunden unter bestimmten Schwellenwerten und AUC, wurden mithilfe des folgenden Modells analysiert:

ijkl ist die Antwortvariable, µ ist der Gesamtmittelwert, Cov ist die Kovariate (Daten, die am Tag 7 jedes Zeitraums vor der Anwendung von Behandlungen gesammelt wurden), Li ist der Effekt des lateinischen Quadrats (i = 1 oder 2), Pj ist der zufällige Effekt von Periode (j = 1–4), F(S)ki ist der zufällige Effekt des Fermenters (F) innerhalb des Quadrats (k = 1–4), TRl ist der Effekt der Behandlung, Dm ist der Effekt des Tages, T × Dlm ist die Wechselwirkung zwischen Behandlung und Tag, und Eijkl ist der Restfehler. Die pH-Daten des Pansens sowie die NH3-N-, d-Lactat-, L-Lactat- und Gesamtlactatkonzentrationen wurden über die Zeit hinweg als wiederholte Messungen in einer Streifendiagrammanordnung der Variablen TAG und ZEIT analysiert, die weiter in das Modell einbezogen wurden. Die in allen Modellen getesteten Kovarianzstrukturen waren: AR (1), ARH (1), CS, TOEP, TOEPH, UN und VC; Es wurde die Struktur mit dem niedrigsten AIC gewählt. Signifikanz wurde bei P ≤ 0,05 und Trends bei 0,05 < P ≤ 0,10 angegeben. Der Tukey-Test wurde verwendet, um Mittelwerte zu vergleichen, wenn Unterschiede beobachtet wurden.

Alle Zahlen wurden mit der Software DataGraph von Visual Data Tools (https://www.visualdatatools.com) erstellt. Alle Rohdaten sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Erin Mullin-Garcia und Emory Burda für ihre Unterstützung bei den experimentellen Verfahren und Analysen. Die Autoren bedanken sich auch für die Beiträge und Diskussionen von Dr. Edzard van Santen und José Eduardo P. Santos von der University of Florida sowie Luiz F. Ferraretto von der University of Wisconsin, Madison. Die Autoren sind auch dankbar für die Finanzierung der Experimente durch das Institute of Food and Agricultural Sciences (IFAS) der University of Florida.

Abteilung für Bevölkerungsgesundheit und Fortpflanzung, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, CA, 95616, USA

Hugo F. Monteiro

Abteilung für Tier-, Veterinär- und Lebensmittelwissenschaften, Universität Idaho, Moskau, ID, 83844, USA

Bruna C. Agustinho

Abteilung für Tierwissenschaften, University of Florida, Gainesville, FL, 32611, USA

Hugo F. Monteiro, Bruna C. Augustine, James R. Vinyard, Takoha Harden, Sarah L. Bennett, Jose A. Maple-Lamb, Efstathios Sarmikasoglou, Anay D. Ravelo, Aneesa Bahman, Sarong So, Elis R. Vieira und Antonio P. Faciola

Abteilung für Agrar- und Umweltwissenschaften, Tuskegee University, Tuskegee, AL, 36088, USA

Härtebonus

Abteilung für Tierwissenschaften, Penn State University, University Park, PA, 16803, USA

Sarah L. Bennett

Abteilung für Veterinärpopulationsmedizin, University of Minnesota, St. Paul, MN, 55108, USA

Anay D. Ravelo

Abteilung für Tierwissenschaften, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand

Sarong So

Abteilung für Tierwissenschaften, Tocantins Federal University, Palmas, Brasilien

Elis R. Vieira

Abteilung für Tierwissenschaften, Nationale Universität Battambang, Battambang, Kambodscha

Sarong So

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Diese Studie wurde von HM und AF entworfen. Das Experiment wurde von HM, BA, JV, TH, SB, JA, ES, AR, AB und EV durchgeführt. Die Probenverarbeitung und -analyse wurde von HM, BCA, ES, AR und SS Data durchgeführt Die Analyse und Manuskripterstellung wurde von HM durchgeführt. Die Überarbeitung des Materials wurde von HM und AF durchgeführt

Korrespondenz mit Antonio P. Faciola.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Monteiro, HF, Agustinho, BC, Vinyard, JR et al. Megasphaera elsdenii und Saccharomyces Cerevisiae als direkt gefütterte Mikroben während einer In-vitro-Provokation mit akuter Pansenazidose. Sci Rep 12, 7978 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11959-2

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Eingegangen: 25. September 2021

Angenommen: 27. April 2022

Veröffentlicht: 13. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11959-2

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Megasphaera elsdenii und Saccharomyces Cerevisiae als direkt gefütterte Mikroben während einer In-vitro-Provokation mit akuter Pansenazidose