Nanodrug rettet Leberfibrose durch synergistische Therapie mit H2O2-Abbau und verzögerter Freisetzung von Saikosaponin b1

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 184 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Hypoxie und die Ansammlung von Wasserstoffperoxid (H2O2) bilden die profibrogene Leberumgebung, die Fibrogenese und chronische Stimulation hepatischer Sternzellen (HSCs) beinhaltet. Katalase (CAT) ist das wichtigste antioxidative Enzym, das H2O2 in Sauerstoff und Wasser katalysiert, das bei verschiedenen Lebererkrankungen, insbesondere bei Leberfibrose, seine Aktivität verliert. In dieser Arbeit werden klinische Proben von Patienten mit Leberzirrhose und Mäusen mit Leberfibrose gesammelt. Die Ergebnisse zeigen, dass die CAT-Abnahme eng mit dem durch Hypoxie induzierten transformierenden Wachstumsfaktor β1 (TGF-β1) korreliert. Anschließend wird ein multifunktionales Nanosystem, das CAT-ähnliches MnO2 und Anti-Fibrose-Saikosaponin b1 (Ssb1) kombiniert, für die antifibrotische Therapie konstruiert. MnO2 katalysiert das angesammelte H2O2 in Sauerstoff und lindert dadurch den hypoxischen und oxidativen Stress, um die Aktivierung von HSCs zu verhindern, und trägt dazu bei, die antifibrotische pharmazeutische Wirkung von Ssb1 zu verstärken. Diese Arbeit legt nahe, dass TGF-β1 für die verminderte CAT bei Leberfibrose verantwortlich ist, und unser entwickeltes MnO2@PLGA/Ssb1-Nanosystem zeigt eine verbesserte antifibrotische Effizienz durch die Entfernung von überschüssigem H2O2 und hypoxischem Stress, was ein vielversprechender therapeutischer Ansatz für die Behandlung von Leberfibrose sein könnte.

Leberfibrose stellt weltweit eine große Gesundheitsbelastung dar, mit zunehmenden Alkoholkonsumstörungen und Virushepatitis-Infektionen1. Heutzutage konzentrieren sich Therapeutika hauptsächlich auf die Hemmung der Aktivierung hepatischer Sternzellen (HSCs) und die Entfernung von überschüssigem abgelagertem Kollagen, das vorübergehend palliativ wirkt und das Risiko eines erneuten Auftretens mit sich bringt2. Eine Leberhypoxie tritt merklich häufiger bei übermäßigem Alkohol-/Drogenkonsum oder Leberschäden auf und löst Lebererkrankungen, insbesondere Leberfibrose, aus3,4. Berichten zufolge ist Hypoxie mit einem erhöhten zellulären oxidativen Stress (OS) und der Hochregulierung von Hypoxie-induzierten Faktoren (HIFs) und dem transformierenden Wachstumsfaktor β1 (TGF-β1) verbunden, die das Fortschreiten der Fibrose erheblich beeinflussen5,6,7,8,9. Während der Hypoxie entsteht an den Qi- oder Qo-Stellen des Komplexes III Superoxid, das dann durch Superoxiddismutase (SOD) schnell in Wasserstoffperoxid (H2O2) umgewandelt wird9,10,11. Hypoxieinduziertes H2O2 fungiert als wichtiger Botenstoff bei der HIF-1α-Stabilisierung und der β-Catenin-Regulation und moduliert den Hedgehog-Signalweg durch HIF-1α3,12. In der Zwischenzeit kann überschüssiges H2O2 Berichten zufolge Makrophagen aktivieren und ist über den Aquaporin-3-Transporter (AQP3) an der Aktivierung von HSCs beteiligt13. Mit anderen Worten: Hypoxie und überschüssiges H2O2 bilden zusammen ein profibrotisches Milieu und beschleunigen dadurch die Entwicklung von Leberfibrose14.

Katalase (CAT) ist das Hauptenzym, das überschüssiges H2O2 in Sauerstoff und H2O zerlegt und die höchste Aktivität in der Leber und den Erythrozyten von Säugetieren aufweist15. Eine verminderte CAT-Aktivität wurde häufig bei vielen klinischen Lebererkrankungen beobachtet und berichtet, darunter Leberfibrose16, nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH)17 und hepatozelluläres Karzinom4. Der Verlust der CAT-Aktivität ist ein wichtiger Teil von Lebererkrankungen und geht normalerweise eher mit einer H2O2-Ansammlung als mit einer Sauerstofferzeugung einher, wodurch die Leberhypoxie und das OS weiter gefördert werden18,19. Überexprimiertes CAT lindert nachweislich die Leberfibrose durch Hemmung der HSC-Aktivierung20,21, erregt jedoch aufgrund der komplexen Funktionsweise und des unklaren Mechanismus nicht genügend Aufmerksamkeit. Nanozyme, die CAT nachahmen, wie beispielsweise Berliner Blau (PB)22, Ceroxid (CeO2)23 und Molybdändisulfid (MoS2)24, wurden verwendet, um H2O2 abzufangen und Sauerstoff für die Leberfibrosetherapie zu produzieren. CeO2 könnte die Lipidperoxidation reduzieren und die Leberregeneration durch Verringerung des oxidativen Stresses fördern25. Die Gründe für die verminderte CAT-Expression in der fibrotischen Leber waren jedoch noch unklar. Um verstärkte antifibrosetherapeutische Wirkungen identifizieren zu können, müssen die Wechselwirkungen zwischen Hypoxie, H2O2 und vermindertem CAT verstanden werden.

Saikosaponin b1 (Ssb1) ist einer der wichtigsten aktiven Bestandteile von Radix bupleuri, einer weit verbreiteten traditionellen chinesischen Medizin, die bei klinischen Lebererkrankungen hilfreich ist26,27. Es wurde gezeigt, dass Saikosaponine die Aktivierung von HSCs reduzieren und Leberzellen vor Schäden schützen28,29. In der aktuellen Studie untersuchten wir klinische Proben von Zirrhosepatienten und ein Mausmodell der Leberfibrose, um hochreguliertes HIF-1α, verringerte CAT-Aktivität und H2O2-Ansammlung in fibrotischen Regionen nachzuweisen. Durch RNA-Sequenzierung der Mausleber stellten wir fest, dass die CAT-Abnahme unter Hypoxie eng mit TGF-β1 zusammenhängt. Wir haben außerdem bestätigt, dass Hypoxie die H2O2-Erzeugung und die TGF-β1-Expression in HSCs induzieren kann, was zeigt, dass Hypoxie mit der CAT-Aktivität durch TGF-β1 verbunden ist. Um dann die Hypoxie und das OS in der fibrotischen Leber zu lindern und die Antifibrose-Wirksamkeit zu steigern, haben wir ein multifunktionales Nanoarzneimittel entwickelt, das CAT-ähnliches MnO2 und Antifibrose-Ssb1 kombiniert. MnO2 katalysierte den Abbau überschüssigen H2O2 und versorgte die hypoxische Leber mit Sauerstoff, was die antifibrotische Wirkung von Ssb1 unterstützen könnte. Wie erwartet zeigten die Ergebnisse, dass die Verbesserung der Hypoxie tatsächlich die Erholung der Leberfibrose erleichterte und zu einer Normalisierung des Sauerstoff- und Redoxgleichgewichts der Leber beitrug.

Berichten zufolge erhöht eine Leberhypoxie die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), und das entstehende H2O2 soll durch CAT abgebaut werden, um das Redoxgleichgewicht aufrechtzuerhalten12. In dieser Arbeit untersuchten wir die Hypoxie und die verringerte CAT in klinischen Proben von Patienten mit Leberzirrhose. Wie in Abb. 1a gezeigt, wurden normales Gewebe und Gewebe mit Zirrhose mit Siriusrot gefärbt, und die Ergebnisse zeigten, dass in der Leber mit Zirrhose eine kontinuierlich erhöhte Kollagenansammlung beobachtet wurde. Anschließend wurden Kollagen I, α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA), HIF-1α und die CAT-Expression von Normal- und Zirrhosegewebe einer Immunfluoreszenzfärbung unterzogen. Im Vergleich zu normalen Geweben waren Kollagen I, α-SMA und HIF-1α in Zirrhosegeweben stark überexprimiert, und die CAT-Expression zeigte dunkle Bereiche, was darauf hinweist, dass Leberfibrose mit Hypoxie und verminderter CAT-Expression einherging.

a Repräsentative Bilder der Sirius-Rot-Färbung (Skalenbalken, 50 μm) und der Immunfärbung für Kollagen I, a-SMA, HIF-1α und CAT (Skalenbalken, 50 μm) in klinischen Proben der angegebenen Patienten. b Repräsentative Hämotoxylin- und Eosin- (H&E) und Masson-Färbung (Skalenbalken, 50 μm), Immunfärbung für a-SMA, HIF-1α (Skalenbalken, 50 μm), CAT (Skalenbalken, 10 μm) von Lebergewebeschnitten aus dem Normalzustand Mäuse und Mäuse, die mit CCl4 für 5 oder 8 W behandelt wurden. Maßstabsbalken: 50 µm. c Repräsentative Western Blot (WB)-Analyse (n = 4, Mittelwert ± SD) der hepatischen HIF-1α-, CAT-, α-SMA-Expression von normalen Mäusen und Mäusen, die 5 und 8 W lang mit CCl4 behandelt wurden (n = 4, Mittelwert ±). SD). d H2O2-Gehalt in der Leber von normalen Mäusen und Mäusen, die 5 oder 8 W lang mit CCl4 behandelt wurden (n = 4, Mittelwert ± SD). *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 (ungepaarter Student-t-Test) im Vergleich zu normalen Mäusen.

Wir untersuchten die Leberhypoxie/H2O2-Veränderung in einem tierischen Leberfibrosemodell weiter und behandelten Balb/c-Mäuse 5 Wochen (W) und 8 Wochen lang mit CCl4, um unterschiedliche Grade der Leberfibrose nachzuahmen. Wie in Abb. 1b, c gezeigt, wurde festgestellt, dass im Vergleich zu mit CCl4 behandelten 5-W-Mäusen ein erhöhtes Hypoxiesignal bei verringerter CAT-Expression bei mit CCl4 behandelten 8-W-Mäusen beobachtet wurde. Anschließend haben wir die H2O2-Konzentration des Lebergewebes ermittelt (Abb. 1d). Wie erwartet war die H2O2-Konzentration in CCl4-behandelten 8-W-Mäusen aufgrund der Glutathion-Deletion (GSH) und des CAT-Mangels mehr als doppelt so hoch wie bei normalen Mäusen30,31. Da H2O2 nachweislich eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Fibrose spielt, ist die katalytische Aktivität von CAT für die Genesung von Fibrose von entscheidender Bedeutung32. Zur weiteren Validierung wurden LX-2 und HSC-T6 12 und 24 Stunden lang mit 5 % O2 behandelt und eine signifikante Abnahme der CAT-Expression wurde in LX-2- und HSC-T6-Zellen festgestellt (Abb. 2d). Diese Ergebnisse verdeutlichten die Tatsache, dass Hypoxie für die CAT-Abnahme verantwortlich war und zur Ansammlung von H2O2 führte.

eine GO-Anreicherungsanalyse von GO-Begriffen einschließlich CAT und HIF-1α in der Leber fibrotischer Mäuse. b Heatmap zur Darstellung der unterschiedlich exprimierten Gene im Zusammenhang mit dem GO-Begriff „Reaktion auf Hypoxie“. c Funktionelle Assoziationsnetzwerke des CAT-korrelierten Gens. Die Analyse basierte auf der STRING-Datenbank zur Ermittlung der Protein-Protein-Interaktion. d Repräsentative WB-Analyse von HIF-1α, TGF-β1, CAT und a-SMA unter unterschiedlicher Behandlung an HSC-T6- und LX-2-Zellen. e WB-Analyse von Foxo3a und CAT von HSC-T6 und LX-2, stimuliert mit TGF-β1 10 ng/ml für 24 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von SIS3. f RT-qPCR-Analyse der CAT-mRNA-Expression in HSC-T6 und LX-2 (n = 3, Mittelwert ± SD, *p < 0,05, **p < 0,01; ***p < 0,001 nach Student-t-Test). g CLSM-Bilder und Mitochondrien in HSC-T6-Zellen. Repräsentative konfokale Bilder der Mito Tracker Deep Red FM- und DCFH-DA-Färbung in HSC-T6 unter 5 % O2-Hypoxiebehandlung. Maßstabsbalken, 10 μm. h Intrazelluläre ROS-Spiegel, analysiert durch Durchflusszytometrie-Analyse. i TGF-β1-Expression in HSC-T6 und LX-2, induziert durch H2O2. j Schematische Darstellung des Hypoxie-regulierenden Mechanismus in HSCs.

Um die Wechselwirkung zwischen Hypoxie und CAT bei Leberfibrose weiter zu bestätigen, wurde die Leber von CCl4-behandelten 8-W-Mäusen und normalen Mäusen einer RNA-Transkriptomanalyse unterzogen. Bei mit CCl4 behandelten Mäusen wurde eine Herunterregulierung der CAT mit statistischer Signifikanz festgestellt, und die Abnahme der CAT betraf GO-Begriffe wie Oxidoreduktaseaktivität, Oxidations-Reduktionsprozess und Reaktion auf Hypoxie (Abb. 2a). Im GO-Begriff „Reaktion auf Hypoxie“ stellten wir fest, dass Hypoxie-korrelierte Egln3-, Hif-1a- und Fibrose-assoziierte Gene (Mmp2, Mmp14, Tgfb1, Tgfb2 und Smad3) bei fibrotischen Mäusen nachweisbar hochreguliert, aber zelluläre Schlüsselantioxidantien waren Enzyme wie CAT und Sod2 waren verringert (Abb. 2b). Die Protein-Protein-Wechselwirkung wurde basierend auf der STRING-Datenbank analysiert und das CAT-korrelierte Netzwerk wurde mit Cystoskop (v.3.8.2) visualisiert. Das profibrogene Master-Zytokin TGF-β1 stand in direktem Zusammenhang mit CAT (Abb. 2c).

In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass TGF-β1 die CAT-mRNA durch die Aktivierung von Smad3 in glatten Atemwegsmuskelzellen stark unterdrückt33,34. Die durch den TGF-β1/Smad3-Signalweg regulierte Expression von Foxo3a (Forkhead-Box-Typ O3a) und nachfolgender CAT-mRNA wurde bei Herzfibrose weiter nachgewiesen35. Um zu bestätigen, dass TGF-β1 für die CAT-Regulation verantwortlich war, wurden HSCs nacheinander mit Hypoxie und TGF-β1 inkubiert, um den Faktor zu überprüfen, der die CAT-Expression beeinflusst (Abb. 2d und ergänzende Abb. 1a, b). In HSC-T6- und LX-2-Zellen wurde beobachtet, dass Hypoxie einen signifikanten Anstieg von TGF-β1 induziert und die CAT-Expression verringert. Mit TGF-β1 behandelte Zellen zeigten eine wirksame Unterdrückung von CAT, was darauf hindeutet, dass Hypoxie eine Hochregulierung von TGF-β1 und damit eine verringerte CAT-Expression verursachte. Der Smad3-spezifische Inhibitor SIS3 wurde verwendet, um die durch TGF-β1 induzierte Smad3-Aktivierung zu hemmen (ergänzende Abbildung 1c). Wie in Abb. 2e gezeigt, wurden mit TGF-β1 behandelte HSCs effektiv aktiviert und die Expression von Foxo3a und CAT herunterreguliert (ergänzende Abb. 1d). Dieser Prozess wurde durch SIS3 aufgrund der Hemmung der Smad3-Aktivierung deutlich blockiert, und die CAT-mRNA-Expression wurde nach der Behandlung aktiver HSCs mit SIS3 stark wiederhergestellt (Abb. 2f). Darüber hinaus war Nrf2 (Nuclear Factor (Erythroid-derived 2)-like 2) ein weiterer wichtiger Regulator von CAT36. Bei Hypoxie und TGF-β1-aktivierten HSCs war die Nrf2-Expression verringert (ergänzende Abbildung 2a, b). Nrf2 wurde durch Nrf2-shRNA weiter zum Schweigen gebracht, und im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde eine verringerte CAT-Expression festgestellt, was darauf hindeutet, dass die Nrf2-Störung zur CAT-Regulation beitrug, die sowohl auf Hypoxie als auch auf die TGF-β1-Induktion reagierte (ergänzende Abbildung 2c – e). Daher könnte TGF-β1, ausgelöst durch Hypoxie, die CAT-Expression durch Hemmung von Foxo3a und Nrf2 verringern, was zu einer starken H2O2-Akkumulation in der Leber führte und ein wichtiges Ziel für die Antifibrosetherapie sein könnte.

Anschließend untersuchten wir die Hypoxie-induzierte H2O2-Erzeugung durch gleichzeitige Anfärbung von 2,7-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) und MitoTracker Deep Red mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) (Abb. 2g) und quantifizierten sie anschließend mittels Durchflusszytometrie ( FCM)-Analyse (Abb. 2h). Die Intensität des DCF war unter Normoxie schwach. Bei der Hypoxiebehandlung nahm die DCF-Fluoreszenz jedoch zu und zeigte eine gute Co-Lokalisierung mit der Mitochondrienregion. Als eine Art ROS könnte H2O2 das OS erhöhen und den Übergang von HSCs in aktivierte Myofibroblasten stimulieren3. Anschließend wurde eine erhöhte H2O2-Konzentration (50 μM) mit HSC-T6-Zellen und LX-2-Zellen inkubiert, und die H2O2-induzierte TGF-β1-Expression wurde in Abb. 2i und den ergänzenden Abb. 1e, f untersucht. Die Ergebnisse deuteten auf einen möglichen Weg zwischen Hypoxie und CAT hin, wie in Abb. 2j dargestellt. Bei einem typischen Eingriff könnte eine Leberhypoxie die H2O2-Erzeugung durch mitochondriale Atmung erhöhen und das daraus resultierende OS aktivierte die TGF-β1-Expression. Überexprimiertes TGF-β1 könnte die CAT-Expression durch Herunterregulierung von Foxo3a und Nrf2 regulieren, was wiederum H2O2 vor der Zersetzung schützte. Dieser Teufelskreis sorgte für eine chronische Stimulation der HSCs und war ein Haupthindernis bei der medikamentösen Therapie gegen Fibrose.

Die Ansammlung von H2O2 in der Leber sorgte für eine chronische Stimulation der HSCs und zerstörte die normale Lebermikroumgebung. Deshalb haben wir eine CAT-ähnliche Verbindung MnO2 eingeführt, um überschüssiges H2O2 zu zersetzen und O2 zu produzieren, was das OS und die Gewebehypoxie lindern könnte37,38. In der vorliegenden Arbeit haben wir ein Nanoarzneimittel mit biologisch abbaubaren Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA)-Nanopartikeln (NPs) entworfen, die ein hydrophobes Antifibrotikum Ssb1 beladen und es dann mit MnO2-Hüllen (MnO2@PLGA/Ssb1 NPs) beschichtet haben (Abb . 3a)39,40. Nach der Injektion und der Körperzirkulation sammelten sich nanoskalige MnO2@PLGA/Ssb1-NPs in der fibrotischen Leber mit erhöhter Gefäßpermeabilität an41. Zelluläres H2O2 wurde weiter zu O2 katalysiert, was die hypoxische Stimulation verbesserte und synergistisch die therapeutische Wirksamkeit des freigesetzten Ssb1 steigerte.

a Darstellung des Katalase-ähnlichen MnO2@PLGA/Ssb1-Nanosystems zur Leberfibrosetherapie durch Modulation der fibrotischen Mikroumgebung. b Repräsentative Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Bilder verschiedener Nanopartikel. Maßstabsbalken, 100 nm. c Durchschnittliche Größenverteilung verschiedener Nanopartikel (n = 3, Mittelwert ± SD). d Zetapotential verschiedener Nanopartikel (n = 3, Mittelwert ± SD). e UV-Vis-Spektren von Ssb1, PLGA, PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1. f HPLC-Spektren von Ssb1, beladen in PLGA/Ssb1- und MnO2@PLGA/Ssb1-Nanopartikeln. g Arzneimittelfreisetzungsrate von PLGA/Ssb1- und MnO2@PLGA/Ssb1-Nanopartikeln (n = 3, Mittelwert ± SD). h O2-Erzeugung verschiedener H2O2-Mengen nach Zugabe von MnO2@PLGA/Ssb1 (Mn-Konzentration = 233 µM). i O2-Erzeugung verschiedener MnO2@PLGA/Ssb1 mit 44 mM H2O2. j O2-Erzeugung von MnO2@PLGA/Ssb1 (Mn-Konzentration = 117 µM) und H2O2 (22 mM) in Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten.

Ssb1-beladene PLGA-NPs (PLGA/Ssb1-NPs) wurden gemäß früheren Untersuchungen synthetisiert. Und MnO2 wurde auf der Oberfläche von PLGA/Ssb1-NPs durch das Redox von Kaliumpermanganat (KMnO4) gezüchtet, um MnO2@PLGA/Ssb1-NPs43 zu konstruieren. Mikroskopische Bilder zeigten die erfolgreiche Beschichtung von PLGA/Ssb1-NPs mit MnO2, insbesondere in Bildern der Rasterelektronenmikroskopie (REM). Die erfolgreiche Beschichtung von MnO2 auf PLGA bot eine harte Unterstützung für die Aufrechterhaltung der sphärischen Morphologie (Abb. 3b). Ergänzende Abbildung 3a zeigte die Elementkartierung von Mn und C in MnO2@PLGA/Ssb1-NPs. Das C-Element war in einem Teil des Auswahlbereichs konzentriert und das Mn-Element war über den Auswahlbereich verteilt. Das zusammengeführte Kartierungsbild unterstützte weiterhin die erfolgreiche Bildung von MnO2 auf der Oberfläche von NPs. Durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser und Zetapotentiale von PLGA/Ssb1- und MnO2@PLGA/Ssb1-NPs wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) gemessen. Die Größe und der Potentialwert von MnO2@PLGA/Ssb1 waren höher als die von PLGA/Ssb1, was sein könnte Dies ist auf die MnO2-Beschichtung auf PLGA/Ssb1-NPs zurückzuführen und sorgte für eine gute In-vitro- und In-vivo-Stabilität (Abb. 3c, d)44,45.

Die Ssb1-Beladung in NPs wurde durch UV-sichtbare (UV-vis) Absorptionsspektroskopie analysiert. Ein charakteristischer Dreifachpeak von Ssb1 innerhalb von 270–400 nm wurde beobachtet, und der Absorptionspeak von PLGA bei 210 nm in PLGA/Ssb1- und MnO2@PLGA/Ssb1-NPs stimmte ebenfalls mit der entworfenen Struktur überein (Abb. 3e). Die genaue Bestimmung des Ssb1-Gehalts in PLGA/Ssb1- und MnO2@PLGA/Ssb1-NPs erfolgte mittels HPLC. Die Standardkurve von Ssb1 wurde erkannt (ergänzende Abbildung 3b), und die Einkapselungseffizienz von Ssb1 in PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1 erreichte bis zu 65 % und 52,5 % (Abb. 3f). Anschließend untersuchten wir die In-vitro-Wirkstofffreisetzung von NPs bei pH 7,4. NPs zeigten eine ähnliche Freisetzungsrate und setzten innerhalb von 28 Stunden etwa 85 % des eingekapselten Ssb1 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 frei (Abb. 3g).

Es ist bekannt, dass MnO2 CAT-ähnliche Enzyme zur Katalyse von H2O2 in H2O und Sauerstoff nachahmt, und nanoskaliges MnO2@PLGA/Ssb1 soll aufgrund seines hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses eine höhere katalytische Effizienz aufweisen46. Die H2O2-Spaltungsfähigkeit von MnO2@PLGA/Ssb1 wurde mit einem Messgerät für gelösten Sauerstoff gemessen. Bei einer Erhöhung der H2O2-Konzentration von 0 auf 44 mM erzielte die MnO2-basierte Nanoplattform (MnO2@PLGA/Ssb1) einen zufriedenstellenden Effekt der O2-Produktion. Wie in Abb. 3h gezeigt, wurde mit zunehmender H2O2-Konzentration die Katalysereaktion offensichtlich verstärkt und der gelöste O2 stieg innerhalb von 50 s schnell von 0,5 mg/L auf 6,9 mg/L. Anschließend wurde die Sauerstofferzeugungseffizienz von MnO2@PLGA/Ssb1 bei verschiedenen Konzentrationen auch mit 44 mM H2O2 untersucht. Eine erhöhte O2-Erzeugung korrelierte mit dem MnO2@PLGA/Ssb1-Katalysatorgehalt, und die Ergebnisse zeigten die katalytische Kapazität des MnO2@PLGA/Ssb1-Nanowirkstoffs gegen H2O2 (Abb. 3i). Wir haben den Einfluss des pH-Werts auf die O2-Erzeugungsrate weiter untersucht (Abb. 3j). In Puffern mit pH 5,0 und pH 6,5 war die O2-Erzeugung etwas höher als in Puffern mit pH 7,2, was eine höhere katalytische Effizienz von MnO2 unter schwach sauren Bedingungen bedeutete.

Ssb1 ist eine hydrophobe antifibrotische Verbindung aus Bupleurumkraut47. In der aktuellen Arbeit wurde seine antifibrotische Wirkung in TGF-β1-aktivierten HSC-T6/LX-2-Zellen nachgewiesen (Abb. 4a und ergänzende Abb. 4a – c). Als effizientes profibrotisches Zytokin wurde TGF-β1 zur Aktivierung von HSCs in Myofibroblasten und zur Hochregulierung der α-SMA-Expression eingesetzt48. Insgesamt könnten 15 μM Ssb1 die Expression von α-SMA und Kollagen I in TGF-β1-stimulierten HSCs signifikant hemmen. Darüber hinaus zeigte die Zytotoxizität von Ssb1, dass aktivierte HSCs empfindlicher auf hochkonzentriertes Ssb1 reagierten als ruhende HSCs. Wir haben außerdem die Expression des apoptotischen Proteins Caspase 3 nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass die gespaltene Caspase 3 in einer gradientenabhängigen Weise erhöht war, was darauf hindeutet, dass Ssb1 die Apoptose aktivierter HSCs induzieren könnte.

a HSC-T6-Zellen wurden TGF-β1 (10 ng/ml) ausgesetzt und 24 Stunden lang mit Ssb1 (0–15 μM) behandelt. Die Expression von Kollagen I, α-SMA und Caspase 3 wurde durch einen Western-Blot-Assay bestimmt. b–e Zelluläre antifibrotische Wirksamkeit von MnO2@PLGA/Ssb1. Die α-SMA- und HIF-1α-Expression der HSC-T6- (b) und LX-2-Zellen (c) mit verschiedenen Behandlungen, denen TGF-β1 ausgesetzt war, wurde durch WB getestet. Die Expressionsniveaus von α-SMA und HIF-1α von HSC-T6- (d) und LX-2-Zellen (e) wurden durch Immunfluoreszenzfärbung bewertet. f Zelluläre ROS wurden durch CLSM in HSC-T6-Zellen mit verschiedenen Behandlungen unter 5 % O2-Hypoxie nachgewiesen. Maßstabsbalken, 50 μm. g, h MnO2@PLGA/Ssb1 könnte Hypoxie-induziertes H2O2 und TGF-β1 reduzieren. Die HIF-1α- und TGF-β1-Expressionsniveaus von HSC-T6 (g) und LX-2 (h) mit verschiedenen Behandlungen, die durch Hypoxie belastet wurden, wurden durch WB untersucht.

Die antifibrotische Wirksamkeit von MnO2@PLGA/Ssb1 wurde in TGF-β1-aktivierten HSC-T6/LX-2-Zellen untersucht. Mitochondriale reaktive Sauerstoffspezies (ROS) nahmen in aktivierten HSCs zu und induzierten dadurch eine stabile Expression von HIF-1α49. Wie in Abb. 4b, c dargestellt, waren α-SMA und HIF-1α in TGF-β1-behandelten Zellen signifikant hochreguliert. In anderen Gruppen hemmten Ssb1-, MnO2- und Ssb1-beladene PLGA/Ssb1-NPs die α-SMA- und HIF-1α-Expression in aktivierten HSCs, und mit MnO2@PLGA/Ssb1 behandelte Zellen zeigten aufgrund der synergistischen Wirkung von MnO2 die beste Antifibroseeffizienz und Ssb1 (Ergänzende Abbildung 4d). MnO2 verringerte die Hypoxie und die ROS-Stimulation von HSCs und verstärkte dadurch die Antifibrosewirkung von Ssb1. Die Expression von α-SMA und HIF-1α wurde durch die Immunfluoreszenz-Färbemethode weiter bewertet und es wurden ähnliche Ergebnisse wie bei WB erzielt (Abb. 4d, e).

Aufgrund der Ergebnisse in Abb. 2d führten wir eine 24-stündige Hypoxiebehandlung (5 % O2) durch, um die Aktivierung von HSC-T6- und LX-2-Zellen zu induzieren. Unter Hypoxie nahm die mitochondriale H2O2-Erzeugung in HSCs zu und induzierte die TGF-β1-Expression, die HSCs in Myofibroblasten umprogrammierte. In Abb. 4f und der ergänzenden Abb. 5a wurde zellulärer ROS zunächst durch CLSM- und FCM-Analysen nachgewiesen. Verglichen mit der mit Hypoxie behandelten Gruppe zeigten mit MnO2@PLGA/Ssb1 inkubierte Zellen aufgrund der Zersetzung von H2O2 eine verringerte DCF-Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass MnO2@PLGA/Ssb1 die durch Hypoxie induzierten ROS reduzieren und das OS von HSCs vermeiden könnte. Anschließend wurde die TGF-β1-Expression von Hypoxie und verschiedenen mit Material behandelten HSCs nachgewiesen. Wie in Abb. 4g, h gezeigt, könnte MnO2@PLGA/Ssb1 die TGF-β1- und HIF-1α-Expression in HSC-T6- und LX-2-Zellen effizient verringern (ergänzende Abb. 4e). Die Ergebnisse zeigten, dass unser entwickeltes MnO2@PLGA/Ssb1-Nanomedikament erfolgreich profibrotische Faktoren reduzierte, was auf mögliche Anwendungen in der Antifibrosetherapie hinweist. Darüber hinaus konnten wir entsprechend der Anreicherung von H2O2 unter Hypoxie auch eine H2O2-induzierte TGF-β1-Expression in HSC-T6 nachweisen (ergänzende Abbildung 5b). Die Behandlung mit MnO2@PLGA/Ssb1 könnte TGF-β1 aufgrund der durch H2O2 in HSCs induzierten Linderung des OS wirksam senken.

NPs wurden mit dem im nahen Infrarot absorbierenden Cyaninfarbstoff 1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyaniniodid (DiR-Iodid) für die optische Bildgebung (PLGA/DiR- und MnO2@PLGA/DiR-NPs)50 markiert. Die In-vivo-Akkumulation von PLGA/DiR und MnO2@PLGA/DiR während der Körperzirkulation wurde mithilfe eines Kleintier-Fluoreszenzbildgebungssystems überwacht. Nach 8-stündiger Injektion schien sich die Fluoreszenz von DiR bei Mäusen anzusammeln und anschließend wurden die Hauptorgane abgebildet (Abb. 5a, b). Im Vergleich zu freiem DiR waren PLGA/DiR und MnO2@PLGA/DiR hauptsächlich in Leber und Lunge konzentriert und hatten eine Partikelgröße von etwa 200 nm. Dieses Phänomen stimmte mit früheren Berichten überein, wonach kugelförmige Partikel über 150 nm dazu neigten, nach der Körperzirkulation hauptsächlich in der Leber und der Lunge eingeschlossen zu werden41,51,52.

a Repräsentative In-vivo-Fluoreszenzbilder von Mäusen, denen DiR-beladene Nanopartikel durch iv-Injektion verabreicht wurden. (n = 3, Mittelwert ± SD, *p < 0,05 nach Student-t-Test). b Ex-Fluoreszenzbildgebung der Leber und anderer wichtiger Organe, 8 Stunden nach der Injektion von DiR-beladenen Nanopartikeln (H, Li, S, Lu und Ki stehen für Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere). c Quantifizierung von Ssb1 in Gewebehomogenaten (n = 6, Mittelwert ± SD). d Bioverteilung des Mn-Elements nach der intravenösen Injektion mit MnO2- und MnO2@PLGA/Ssb1-Nanopartikeln (n = 5, Mittelwert ± SD).

Die Bioverteilung von Ssb1 und MnO2 in den Hauptorganen wurde durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) zur Dosierungsbestimmung in der antifibrotischen Therapie weiter quantifiziert. Wie in Abb. 5c gezeigt, verteilte sich Ssb1 hauptsächlich in Leber, Lunge und Niere, wohingegen die Verteilung nur von Ssb1, PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1 keine signifikanten Unterschiede aufwies. Abbildung 5d zeigt, dass die Mangankonzentrationen von MnO2 und MnO2@PLGA/Ssb1 in den Hauptorganen ähnlich waren und das Manganelement insbesondere in Leber und Niere konzentriert war. Die quantitativen Ergebnisse von Ssb1 und Mn stimmten mit denen der DiR-markierten In-vivo-Bildgebung überein und könnten somit als Leitfaden für die folgende therapeutische Dosierung dienen.

Fibrotische Mäuse wurden mit 40 % CCl4-Injektion für 5 W etabliert und dann mit WB, Hämatoxylin & Eosin (H&E) und Massons Trichrom-Färbung analysiert (ergänzende Abb. 6a, b). Basierend auf der Bioverteilung von Ssb1 und MnO2 in der Mausleber wurde die therapeutische Dosierung berechnet und einmal pro Woche intravenös injiziert (Abb. 6a). Nach dreiwöchiger Behandlung wurden die Mäuse zur Bestimmung der Antifibrose-Indizes getötet. Mit Ssb1 behandelte Mäuse wurden einer RNA-Sequenzierung unterzogen, und differenziell exprimierte Gene wurden größtenteils im KEGG-Signalweg „ECM-Rezeptor-Interaktion“ angereichert. In der Heatmap dieses Signalwegs war offensichtlich, dass Kollagengene wie Col1a1, Col1a2, Col4a1, Col4a2, Col4a5, Col6a1, Col6a2 und Col6a3 in der Ssb1-Gruppe signifikant verringert waren, was darauf hindeutet, dass Ssb1 die Kollagenexpression in der fibrotischen Leber herunterregulieren könnte ( Ergänzende Abbildung 7).

a Gesamtablauf des Tierversuchs (CCl4-induzierte Leberfibrose). b H2O2-Gehalt der Leber bei unterschiedlicher Behandlung (n = 3, Mittelwert ± SD, #Modell im Vergleich zum Normalzustand, *andere Gruppen im Vergleich zum Modell). c Die hepatischen HIF-1α-, Kollagen I-, TGF-β1- und α-SMA-Expressionsniveaus wurden mittels WB gemessen. d Leber-CAT, HIF-1α wurden durch Immunfluoreszenzfärbung bewertet (Skalenbalken, 50 μm). e α-SMA- und TUNEL-Färbung von Mausgewebeschnitten (Maßstabsbalken, 50 μm). f Repräsentative H&E- und Masson-gefärbte Lebergewebeschnitte. Blaue Bereiche in Masson-gefärbten Schnitten weisen auf Kollagenablagerungen in fibrotischen Lebergeweben hin (Maßstabsbalken, 100 µm). g Die Serumspiegel von AST, ALT, TBIL und ALP wurden durch biochemische Tests gemessen (n = 5, Mittelwert ± SD). h Vier Indikatoren (HA, LN, PCIII und IV-C) der Serumleberfibrose wurden mittels ELISA gemessen (n = 5, Mittelwert ± SD). (*p < 0,05, **p < 0,01; ***p < 0,001 nach Student-t-Test).

Wie in Abb. 6b gezeigt, war H2O2 in unbehandelter fibrotischer Leber stark angereichert und nahm in den mit MnO2, PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1 behandelten Gruppen ab. Die Verringerung des H2O2-Gehalts verringerte das OS der Leber und vermied dadurch eine zusätzliche Aktivierung ruhender HSCs53. Die Expression von HIF-1α und TGF-β1 in mit MnO2@PLGA/Ssb1 behandelten Mäusen war erwartungsgemäß aufgrund der Zersetzung von H2O2 und der O2-Erzeugung deutlich reduziert (Abb. 6c und ergänzende Abb. 6c). Darüber hinaus waren aufgrund der synergistischen Koordination von MnO2 und Ssb1 auch die fibrotischen Proteine ​​α-SMA und Kollagen I in mit MnO2, PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1 behandelten Mäusen verringert. Lebergewebe wurden in Scheiben geschnitten und immunfluoreszenzgefärbt, um die Gewebeexpression von HIF-1α, CAT und α-SMA zu überwachen (Abb. 6d und ergänzende Abb. 6d). Im Vergleich zu fibrotischen Mäusen und der Ssb1-Therapie wurde die Hypoxie bei mit MnO2@PLGA/Ssb1 behandelten Mäusen wirksam gelindert und führte zu einer Herunterregulierung von HIF-1α und α-SMA in der Leber. Die TUNEL-Färbung wurde mit gleichzeitiger Färbung von α-SMA durchgeführt. In Abb. 6e zeigten nanoskaliges PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1 eine effizientere Apoptose als Ssb1, was auf ein höheres Nutzungsverhältnis von Ssb1 in Nanoformen hinweist. Die mit H&E und Masson gefärbten Leberschnitte wurden weiter untersucht, und die Ergebnisse zeigten, dass eine Leberschädigung bei unbehandelten Mäusen eine auffällige entzündliche Zellaggregation und kreuz und quer verlaufende Kollagenfasern hervorrief. Dieses Phänomen wurde bei mit MnO2@PLGA/Ssb1 behandelten Mäusen zur Wiederherstellung der Fibrose sichtbar gemildert (Abb . 6f).

Eine zusätzliche hämatologische Untersuchung (Abb. 6g) ergab, dass sich die Leberfunktionsindizes, einschließlich TBIL, ALT und AST, in der MnO2@PLGA/Ssb1-Gruppe deutlich erholten, was darauf hinweist, dass MnO2@PLGA/Ssb1 tatsächlich wirksam für die Antifibrosetherapie war. Vier Indikatoren (HA, LN, PIIINP und IV-C) des Mäuseserums wurden auch durch einen enzymgebundenen ImmunoSorbent-Assay (ELISA) gemessen, um eine weitere Übereinstimmung mit den klinischen Testindizes zu gewährleisten. Wie in Abb. 6h gezeigt, sanken die Serumspiegel von Laminin (LN), Kollagen Typ IV (CIV) und PIIINP bei fibrotischen Mäusen, denen MnO2@PLGA/Ssb1 injiziert wurde, stärker als bei Mäusen, denen PBS injiziert wurde. Alle diese Ergebnisse zeigten, dass die Kombination von MnO2 und Ssb1 tatsächlich eine verbesserte Wirksamkeit gegen Fibrose erzielte.

Die biologische Sicherheit von Ssb1, PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1 wurde sowohl in vitro als auch in vivo untersucht, um die Sicherheit unserer Materialien zu gewährleisten. Ruhende HSC-T6- und LX-2-Zellen wurden zunächst mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ssb1, PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1 inkubiert (Abb. 7a, b). 50 μM Ssb1 störten die Lebensfähigkeit der Zellen sowohl in HSC-T6 als auch in LX-2 nicht, und mit Ssb1 beladenes PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1 zeigten keine zusätzliche Belastung für das Zellwachstum, was auf eine gute Biokompatibilität dieses antifibrotischen Nanoarzneimittels hinweist. Anschließend wurde die akute In-vivo-Toxizität des Nanoarzneimittels für Balb/c-Mäuse bei dreitägiger kontinuierlicher Injektion untersucht. Gewebe (Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere) wurden gesammelt und durch H&E-Färbung analysiert (Abb. 7c). Wie in Abb. 5b gezeigt, reichern sich PLGA/Ssb1- und MnO2@PLGA/Ssb1-NPs hauptsächlich in Leber und Lunge an, und histopathologische Untersuchungen von Leber und Lunge zeigten keine Bedeutung für die Infiltration entzündlicher Zellen oder die Gewebemorphologie. Die hämatologische Untersuchung ergab ebenfalls nahezu keine Unterschiede zwischen den ALT-, AST- und ALP-Werten im Blut (Abb. 7d). Diese Ergebnisse verdeutlichen die zufriedenstellende biologische Sicherheit der verwendeten Ssb1-, MnO2- und Ssb1-beladenen NPs.

Zelllebensfähigkeit von HSCs (a) und LX-2-Zellen (b) mit unterschiedlichen Materialkonzentrationen (n = 4, Mittelwert ± SD). H&E-gefärbte Bilder (c) und Blutbiochemie (d) sowie von Organen einschließlich Leber, Milz, Niere, Herz und Lunge von Mäusen, denen 3 Tage lang 8,25 mg/kg Ssb1 pro Tag injiziert wurden (n = 5, Mittelwert ± SD) . Bei mit Ssb1-Nanopartikeln behandelten Mäusen wurden keine offensichtlichen Organschäden oder Läsionen beobachtet (Maßstab, 100 μm).

TGF-β1 ist das klassische profibrotische Zytokin zur Steuerung der HSC-Aktivierung und wurde häufig für die Konstruktion von In-vitro-Fibrosemodellen verwendet54. In früheren Arbeiten wurde der Einfluss von TGF-β1 auf CAT in glatten Atemwegsmuskelzellen untersucht, fand jedoch keine größere Beachtung33. In den letzten Jahrzehnten wurde eine verminderte CAT-Aktivität in der Leber-/Lungenfibrose55 beobachtet, die Berichten zufolge für das zelluläre Redox-Ungleichgewicht verantwortlich ist56. Die vorliegende Studie zeigte, dass Leberhypoxie eine erhöhte TGF-β1-Expression induziert, die die CAT-Expression durch Herunterregulierung von Foxo3a und Nrf2 in HSCs wirksam hemmte. Als Folge der Leber-CAT-Hemmung kam es anschließend zu einer erhöhten H2O2-Akkumulation und stabilisiertem HIF-1α im fibrotischen Bereich. Darüber hinaus könnten H2O2 und HIF-1α die Hochregulierung von TGF-β1 weiter stimulieren, was einen Teufelskreis in Gang setzte und als schwierige Barriere für die Behandlung von Leberfibrose fungierte13.

Wir schlugen vor, dass die Hypoxie und das OS der Leber eine chronische und konstante Stimulation der HSCs bewirken und dadurch die Wiederherstellung der Fibrose erschweren. In der profibrotischen Umgebung verringerte TGF-β1 die CAT-Aktivität und induzierte dann eine H2O2-Akkumulation. Das überschüssige H2O2 wiederum erhöhte TGF-β1 weiter und führte zu einem Teufelskreis. Aus diesem Grund wurde H2O2 als Ziel ausgewählt, um den Kreis zu durchbrechen, und MnO2 wurde verwendet, um eine CAT-ähnliche Aktivität für die H2O2-Zersetzung darzustellen. MnO2 veränderte die fibrotische Mikroumgebung, indem es Hypoxie und OS verbesserte und dadurch einen profibrotischen Reiz von der Quelle reduzierte. Es wurde berichtet, dass Ssb1 und der deglykosylierte Metabolit das Leber-Targeting durch Hemmung von CYP3A457 verbessern. Darüber hinaus könnten Saikosaponine, einschließlich Ssb1, die Leber vor CCl4-induzierten Leberschäden schützen58. Wie erwartet konnte die alleinige Behandlung mit Ssb1 die α-SMA-Expression in In-vitro-Experimenten hemmen, war jedoch bei der Umkehrung der Leberfibrose von Balb/c-Mäusen nur minimal wirksam, und MnO2@PLGA/Ssb1 zeigte in In-vitro- und In-vivo-Experimenten eine effizientere therapeutische Wirkung.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die Hypoxie und das OS der Leber ein wichtiger Faktor bei der Leberfibrogenese sind und dass der durch Hypoxie induzierte TGF-β1 die CAT-Expression in HSCs reguliert. Das konstruierte MnO2@PLGA/Ssb1-Nanomedikament zeigte die Fähigkeit, Leberhypoxie und OS zu lindern und die antifibrotische Wirksamkeit von Ssb1 zu verbessern; Somit kann es ein therapeutischer Ansatz zur Behandlung von Leberfibrose sein. Basierend auf dieser Strategie können vielversprechendere Lösungen gegen Hypoxie und OS bei anderen fibrotischen Erkrankungen wie Lungenfibrose und Nierenfibrose eingesetzt werden.

Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der Zhejiang Chinese Medical University (Hangzhou, China, Projekt-Nr. SYXK (浙) 2021-0012) genehmigt und alle Tiere wurden gut gepflegt. In Paraffin eingebettetes menschliches Lebergewebe wurde vom First Affiliated Hospital der Guizhou University of Traditional Chinese Medicine bezogen und von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Guizhou University of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Projekt Nr. K2021-066).

Ssb1 (Desit, Chengdu, China), PLGA (Lactid/Glycolid = 50/50; MW: 94.000 Da; MedChemExpress, USA), Polyvinylalkohol (PVA; BBI Co., Ltd., Shanghai, China), 2-( N-Morpholin)ethansulfonsäure (MES; Heowns Biochem LLC, Tianjian, China), KMnO4 (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China), Puffer für den Radioimmunpräzipitationstest (RIPA) (Solarbio, Peking, China), Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF, 1:100, Cell Signaling Technology, MA, USA) und 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT; Solarbio, Peking, China) wurden gekauft und wie erhalten verwendet. TUNEL, DCFH-DA und DiR-Iodid wurden von Beyotime Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Fötales Rinderserum (FBS), Trypsin-EDTA-Lösung (0,25 %) und Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) wurden von Gibco (Burlington, Kanada) bezogen. Alle anderen Chemikalien und Reagenzien mit der höchsten verfügbaren Reinheit wurden aus kommerziellen Quellen bezogen.

Eine Immunfluoreszenzfärbung wurde an gefrorenen Schnitten (4 μm dick) durchgeführt, die mit der Mischung aus Methanol und Aceton fixiert wurden. Die Schnitte wurden mit 5 % Ziegenserum blockiert und mit speziellen Primärantikörpern (Collagen I, 1:1000, 14695-1-AP, Proteintech; α-SMA, 1:1000, cs19245, Cell Signaling Technology (CST); HIF) inkubiert -1α, 1:1000, cs36169, CST; und CAT, 1:2000, 66765-1-Ig, Proteintech) bei 4 °C über Nacht, gefolgt von Alexa Fluor 488-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) sekundär Antikörper (1:200, A0423, Beyotime). Abschließend wurden die Dias mit DAPI montiert. Alle Schnitte wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (ZEISS, AXIO SCOPE.A1) beobachtet und analysiert. In Paraffin eingebettetes menschliches Lebergewebe wurde rehydriert und dann mit einem Sirius Red-Färbekit (RS1220, G-CLONE) gefärbt, um die Kollagenverteilung zu überwachen.

Die menschliche HSC-Linie LX-2 wurde von Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Die Rattenleber-Sternzelllinie HSC-T6 wurde großzügig von Prof. Su Tao (Guangzhou University of Chinese Medicine) zur Verfügung gestellt. LX-2- und HSC-T6-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % (v/v) FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert.

Zur Hypoxiestimulation wurden die HSCs 24 Stunden lang mit serumfreiem Medium inkubiert. Die Kulturplatten wurden dann in einer Hypoxie-Inkubatorkammer (Billups-Rothenberg, CA, USA) inkubiert, die mit einer Gasmischung aus 5 % CO2 und 95 % N2 gespült wurde, bis die Sauerstoffspannung auf 5 % abfiel. Die Hypoxie-Inkubatorkammer wurde verschlossen und weitere 24 oder 48 Stunden bei 37 ° C inkubiert. In der Kontrollgruppe wurden die Zellen unter Normoxie (21 % Sauerstoffdruck) kultiviert, und mit TGF-β1 (10 ng/ml) belastete Zellen wurden als Positivkontrolle in Normoxie kultiviert.

Die Smad3-Aktivierung wurde mit dem spezifischen Inhibitor SIS3 (MACKLIN, s872443) gehemmt. Für die Hemmungsexperimente wurden die Zellen 1 Stunde lang mit SIS3 bei 3 μM inkubiert, bevor TGF-β1 (10 ng/ml, 24 Stunden) inkubiert wurde. Nach 24 Stunden wurden die Zellen für WB und PCR-Text gesammelt.

Die gesamte zelluläre RNA wurde mit dem Eastep Super Total RNA Extraction Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega, China) extrahiert. Die Quantifizierung und Konzentration der RNA wurden mit dem NanoDrop™ 2000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientifific, USA) gemessen. cDNA wurde aus 1 μg Gesamt-RNA unter Verwendung des Yfx Script First Strand cDNA Synthesis Kit (YIFEIXUE BIO TECH, China) synthetisiert. Die Echtzeit-PCR wurde mit 2x SYBR Green Fast qPCR Master Mix und dem Light Cycle 96 System (Roche) gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt. Die Primersequenzen wurden wie folgt gezeigt: Ratten-Katalase-I-Vorwärtsprimer: 5′-CCCAGAAGCCTAAGAATGCAA-3′; Rückwärtsprimer: 5′-TCCCTTGGCAGCTATGTGAGA-3′; Ratten-b-Actin-Forward-Primer: 5′-CCCGCGAGTACAACCTTCTTG-3′; Rückwärtsprimer: 5′-TCATCCATGGCGAACTGGTGG-3′; Humaner Katalase-I-Forward-Primer: 5′-CTTCGACCCAAGCAACATGC-3′; und Rückwärtsprimer: 5′-ATTTGGAGCACCACCCTGATT-3′; Das relative Expressionsniveau wurde mithilfe der 2-ΔΔCt-Gleichung berechnet. Alle Tests wurden mit drei biologischen Wiederholungen durchgeführt.

Nrf2-shRNA-Plasmide wurden von Shanghai Genechem Co. Ltd. (Shanghai, China) gekauft, und die Sequenzergebnisse sind in Supplementary Data 1 verfügbar. Nrf2 wurde durch Transfektion mit Nrf2-shRNA oder einem leeren Plasmid als Kontrolle ausgeschaltet. Kurz gesagt, HSC-T6-Zellen wurden auf einer Platte mit 12 Vertiefungen bis zu einer Konfluenz von 60–70 % gezüchtet. HSC-T6-Zellen wurden mit den Plasmiden (1 μg) inkubiert, die mit dem Lipofectamine 3000 Transfection Kit (Invitrogen, USA) umhüllt waren.

Der intrazelluläre ROS-Spiegel wurde mithilfe der Fluoreszenzsonde DCFH-DA59 überwacht. In einem typischen Verfahren wurden HSCs mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen/Well in einer Glasbodenschale mit unterschiedlichen Behandlungen Normoxie und Hypoxie (5 % O2) ausgesetzt. Etwa 24 Stunden später wurden die Zellen mit 10 μM DCFH-DA und 100 nM Mito Tracker Deep Red FM in einer Arbeitslösung bei 37 °C 30 Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt und die HSC-Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Fluoreszenzsignale wurden mit einem CLSM-System (Zeiss, LSM880, Deutschland) und CytoFlex-Durchflusszytometrie (Beckmancoulter, CytoFlex, USA) analysiert.

Ssb1-beladene PLGA-NPs (PLGA/Ssb1-NPs) wurden durch einen Emulsionslösungsmittelverdampfungsprozess hergestellt. PLGA und Ssb1 wurden in Aceton in einer Konzentration von 10 bzw. 2 mg/ml gelöst. Dann wurde 1 ml der vorbereiteten Acetonlösung tropfenweise zu 4 ml Polyvinylalkohol (PVA)-Lösung (10 mg/ml) in einem Ölbad gegeben, das mit einem Magnetrührer mit einer Geschwindigkeit von 200 Zyklen pro Minute und 37 °C erhitzt wurde. Die resultierende Lösung wurde dann 6 Stunden lang gerührt, um die Acetonlösung vollständig verdampfen zu lassen. Abschließend wurden die NPs 10 Minuten lang bei 15.000 × g zentrifugiert, um überschüssiges PVA zu entfernen, und zweimal mit Reinstwasser gewaschen, um den gereinigten Ssb1/PLGA-Kern zu erhalten.

Zur Herstellung von MnO2@PLGA/Ssb1-NPs wurde geschichtetes Manganoxid auf der Oberfläche von PLGA/Ssb1-NPs in MES-Puffer (pH 5,9) durch Oxidations-Reduktions-Methode nach Zugabe von 5 mM Kaliumpermanganat für 30 Minuten unter Ultraschallbedingungen gebildet. Anschließend wurden die NPs 10 Minuten lang bei 15.000 g zentrifugiert, um mögliche freie Manganoxid-NPs und das MES zu entfernen, und zweimal mit Reinstwasser gewaschen, um die gereinigten MnO2@PLGA/Ssb1-NPs zu erhalten.

Die hydrodynamische Größenverteilung und das Oberflächenpotential von NPs wurden bei 25 °C mit einem DLS (ZEN 3600 Zetasizer, Malvern) gemessen. Die Oberflächenmorphologie von NPs wurde mittels REM und Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet. Elementkartierungen wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop (FEI Talos F200S) durchgeführt. Der Mangangehalt wurde mit einem ICP-MS-System (Thermo Fisher ICAP QC) gemessen.

Die MnO2@PLGA/Ssb1-NPs wurden zunächst in Acetonitril gelöst und dann mit Ultraschall behandelt, um eine vollständige Ssb1-Auflösung sicherzustellen. Die Ssb1-Konzentration wurde durch HPLC (Agilent Technologies, USA) unter den folgenden Bedingungen bestimmt. Die HPLC-Säule war eine XDB-C18-Säule (4,6 × 250 mm, 5,0 μm, Agilent Technologies) und die mobile Phase bestand aus Acetonitril und Wasser. Die Säulentemperatur betrug 30 °C und wurde bei 254 nm nachgewiesen. Die Flussrate betrug 1,0 ml/min und das Injektionsvolumen betrug 10 μl. Die Wirksamkeit der Arzneimittelverkapselung wurde auf der Grundlage der Verkapselungseffizienz (EE) im Verhältnis zum gesamten in der Verschreibung enthaltenen Arzneimittel geschätzt.

Für eine In-vitro-Freisetzungsstudie wurden in Reinstwasser gelöste PLGA/Ssb1@MnO2- und PLGA/Ssb1-Proben in Dialysemembranbeutel (MWCO: 1000; Scientific Research Special) gegeben und in 2 ml des Freisetzungsmediums PBS (0,01 M) suspendiert pH-Wert 7,4. Der Freisetzungstest wurde bei 37,0 ± 0,5 °C und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min/min durchgeführt. Nachdem in vorgegebenen Zeitintervallen 1 ml des Lösungsmediums aus der Lösung außerhalb der Dialysebeutel entnommen wurde, wurde das gleiche Volumen der entsprechenden Freisetzungsmediumlösung nachgefüllt. Die Konzentration von Ssb1, das von NPs in das Freisetzungsmedium freigesetzt wurde, wurde mithilfe eines UV-Vis-Assays quantifiziert.

Der erzeugte O2 wurde mit einem JPSJ-605F-Messgerät für gelösten Sauerstoff in einer Umgebung gemessen, die mit 3 ml flüssigem Paraffin versiegelt war, um die Luft zu isolieren. Vor der Untersuchung wurde das gelöste O2 durch sprudelnden Stickstoff ausgestoßen, bis der Wert auf 0,5 mg/L sank. Lösungen (10 ml), die H2O2 in unterschiedlichen Konzentrationen (0, 11, 33 und 44 mM) enthielten, wurden zu MnO2@PLGA/Ssb1 (Mn-Konzentration: 233 µM) gegeben, um O2 zu erzeugen. Die Messwerte des Messgeräts für gelösten Sauerstoff wurden 50 Mal alle 10 s aufgezeichnet. Verschiedene Konzentrationen von MnO2@PLGA/Ssb1 (Mn-Konzentrationen: 0, 58, 176 und 233 μM) wurden mit 44 mM H2O2 nachgewiesen und der gelöste O2 wurde auf die gleiche Weise wie oben aufgezeichnet. Danach wurde die MnO2@PLGA/Ssb1 (Mn: 117 μM)-Katalyse von H2O2 (22 mM) in Puffern mit pH 5,0, pH 6,5 und pH 7,2 durch das gelöste O2 nachgewiesen.

MTT wurde verwendet, um die Zytotoxizität von Ssb1 auf ruhenden und TGF-β1-aktivierten HSC-T6/LX-2-Zellen zu bestimmen. HSC-T6- und LX-2-Zellen wurden getrennt auf Kulturplatten mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 1 × 104 Zellen/Vertiefung ausgesät und bei 37 °C inkubiert. Nach 12 Stunden wurden die Zellen für ruhende HSCs auf serumfreies DMEM übertragen und für aktivierte HSCs 30 Minuten lang mit 10 ng/ml TGF-β1 behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ssb1 behandelt und 24 Stunden lang co-kultiviert. Dann wurden 20 μl MTT (5 mg/ml) hinzugefügt und 4 Stunden lang inkubiert. Als sich Formazan bildete, wurde die Kultur entfernt und 150 μl DMSO hinzugefügt, um das Formazan aufzulösen. Die Werte der optischen Dichte wurden bei 570 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Bio-Rad) gemessen.

HSC-T6- und LX-2-Zellen wurden in Kulturplatten mit sechs Vertiefungen in einer Dichte von 5 × 105 Zellen/Vertiefung ausgesät und bei 37 °C inkubiert. Nach 12 Stunden wurden die Zellen auf serumfreies DMEM übertragen und 30 Minuten lang mit 10 ng/ml TGF-β1 behandelt und dann 24 Stunden lang mit 5, 10, 15 μM Ssb1 versetzt. Die Expression von Kollagen I, α-SMA und Caspase 3 wurde mithilfe von WB quantifiziert.

Um die antifibrotische Wirksamkeit der verschiedenen Ssb1-haltigen Formulierungen zu testen, wurden HSC-T6- und LX-2-Zellen auf Kulturplatten mit sechs Vertiefungen in einer Dichte von 5 × 105 Zellen/Vertiefung ausgesät und bei 37 °C inkubiert. Nach 12 Stunden wurden die Zellen auf serumfreies DMEM übertragen und 30 Minuten lang mit 10 ng/ml TGF-β1 behandelt und dann 24 Stunden lang mit verschiedenen Formulierungen (15 μM Ssb1) versetzt. Vor der medikamentösen Intervention wurden die Zellen 24 Stunden lang in serumfreiem DMEM synchronisiert. Für HSC-T6- und LX-2-Zellen wurde das Medium dann durch verschiedene Lösungen ersetzt: (1) serumfreies DMEM, (2) serumfreies DMEM mit 10 ng/ml TGF-β1, (3) serumfreies DMEM mit 10 ng/ml TGF-β1 und 15 μM Ssb1, (4) serumfreies DMEM mit 10 ng/ml TGF-β1 und MnO2-NPs (beladen mit 9,9 μM Mn); (5) serumfreies DMEM mit 10 ng/ml TGF-β1 und PLGA/Ssb1 (beladen mit 15 μM Ssb1); (6) serumfreies DMEM mit 10 ng/ml TGF-β1 und MnO2@PLGA/Ssb1 (beladen mit 15 μM Ssb1, 9,9 μM Mn). Nach 24-stündiger Behandlung wurden die Zellen verwendet, um die Expression von fibrotisch bedingten Proteinen mithilfe von WB- und Immunfluoreszenz-Färbeanalysen zu bewerten. Für weitere Experimente wurden die Zellen 24 Stunden lang einer Hypoxie oder 50 μM H2O2-Behandlungen ausgesetzt, während andere Abschnitte unbehandelt blieben.

Die Gewebeverteilung von NPs wurde unter Verwendung von DiR-beladenen NPs anstelle von Ssb1-beladenen NPs50,60 bestimmt. Mäuse wurden anästhesiert und freies DiR, PLGA/DiR und MnO2@PLGA/DiR (DiR/Körpergewicht = 2,5 mg/kg, 100 μl) wurde den Mäusen intravenös injiziert. 0,5, 1, 4 und 8 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse mit Isofluran anästhesiert und einer In-vivo-Fluoreszenzbildgebung mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (AniView600) bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 745 bzw. 800 nm unterzogen. Nach 8 Stunden wurden die Mäuse getötet und dann wurden ihnen Herz, Leber, Lunge, Milz und Nieren für die Ex-vivo-Bildgebung mit demselben System entnommen.

Zur Messung der Bioverteilung wurden gesunden Balb/c-Mäusen Ssb1, MnO2 und PLGA/Ssb1 iv injiziert (100 μl pro Maus; Dosierung = 8,25 mg/kg bezogen auf die Ssb1-Gewichtskonzentrationen). Den Kontrollgruppen wurden 100 μl PBS iv injiziert. Pro Gruppe wurden sechs Mäuse verwendet. Ihre Hauptorgane, einschließlich Herz (H), Leber (L), Milz (S), Lunge (Lu) und Niere (K), wurden 8 Stunden nach der Injektion entnommen. Die Organe wurden gewogen. Die Gewebe wurden in PBS homogenisiert. Ssb1 wurde durch Proteinpräzipitation aus Geweben extrahiert. Etwa 200 µL Homogenat wurden mit 400 µL Acetonitril (4 °C) behandelt und 3 Minuten lang vortexiert. Die Gemische wurden 5 Minuten lang bei 15.000 × g (4 °C) zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und analysiert.

Die Verteilung von Ssb1 in verschiedenen Formulierungen wurde mittels LC-MS/MS analysiert. Der Negativmodus wurde auf dem Waters Xevo G2-XS QTOF-Massenspektrometer (Waters, Manchester, UK) betrieben und mit einem Acquity I-Klasse UPLC-System (Waters, Milford, USA, Acquity HSS T3-Säule) gekoppelt. Der Massenanalysator scannte einen Massenbereich von 50–2000 Da im Vollscan mit einer Scanzeit von 0,1 s für schnelles DDA und über m/z 150–1300 für MS/MS mit derselben Scanzeit. LockSpray wurde mit 10 ng/L Leucin-Enkephalin-Lösung bei einer Flussrate von 10 μL/min durchgeführt. Der UPLC-Elutionsgradient zur Trennung war wie folgt: 20 % Lösungsmittel B (Acetonitril) bei 0 min; 52 % des Lösungsmittels B nach 12 Min.; 90 % des Lösungsmittels B nach 22 Min.; und 20 % Lösungsmittel B bei 30 Min. Die Flussrate betrug 0,3 ml/min. Die Datenanalyse wurde mit der Software MassLynx V4.1 (Waters, Milford, USA) durchgeführt. Das Analysezertifikat wurde mit ACQUITY UPLC® HSS T3, 1,8 µL (Waters, Manchester, UK) erstellt.

Der Mn-Gehalt wurde mittels ICP-MS gemessen. Organe (50 µL) wurden in Szintillationsfläschchen überführt. Salpetersäure (100 µL) wurde zugegeben, die Fläschchen wurden verschlossen und die Organe wurden 20 Stunden lang bei 37 °C verdaut. Nach Verdünnung von 100 µL Organverdau mit 1 ml Reinstwasser wurde der Mn-Gehalt mithilfe von ICP anhand der für jedes Tier verwendeten Injektionsvolumina berechnet (0,16–0,22 µmol pro Maus; im Durchschnitt betrug die verabreichte MnO2-Dosis 10 µmol/kg mit 0,2 µmol /Maus)

Alle experimentellen Verfahren erhielten die Genehmigung des institutionellen und lokalen Ausschusses für die Pflege und Verwendung von Tieren an der Zhejiang Chinese Medical University (Hangzhou, China). Ganze Tiere wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health human versorgt. Männliche Balb/c-Mäuse mit einem Gewicht von etwa 18–22 g wurden vom Center of Experimental Animal der Zhejiang Chinese Medical University (Hangzhou, China) gekauft. Die Mäuse wurden bei 25 °C gefüttert und einer Luftfeuchtigkeit von 40–60 % ausgesetzt, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Wasser und Laborfutter, sofern nicht anders angegeben. Alle Mäuse wurden vor Beginn der Experimente eine Woche lang an ihre Umgebung angepasst. Eine Mischung aus CCl4 (0,06 ml/20 g Körpergewicht) in Olivenöl (2:3 (v/v)) wurde verwendet, um Leberfibrose bei Mäusen durch zweimal wöchentliche subkutane Injektion über 5 Wochen (W) oder 8 W auszulösen. Mäuse In unbehandelten Gruppen wurde das gleiche Volumen Maisöl verabreicht wie in der gesunden Kontrollgruppe.

Für die therapeutische Studie wurden männliche Balb/c-Mäuse nach 5 W 40 %iger CCl4-Verabreichung zufällig in sieben Gruppen eingeteilt (5 Mäuse pro Gruppe). Anschließend wurden die Mäuse einmal pro Woche für 3 W mit den folgenden Lösungen behandelt: Gruppe 1, Kontrollgruppe; Gruppe 2, PBS durch Injektion in die Schwanzvene; Gruppen 3–6, fibrotische Mäuse (Ssb1/Körpergewicht = 10:1 mg/kg), denen intravenös freies Ssb1, MnO2, PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1, suspendiert in 100 ml sterilem PBS, injiziert wurden. Den Mäusen der Gruppen 2–6 wurde CCl4 einmal pro Woche für 6–8 W subkutan injiziert, und der Kontrollgruppe wurde das gleiche Volumen Olivenöl verabreicht.

Einen Tag nach der letzten Injektion wurden alle Mäuse hingerichtet und ihr Blut und ihre Leber entnommen. Die Serumspiegel von alkalischer Phosphatase (ALP), Aspartataminotransferase (AST) und Alaninaminotransferase (ALT) wurden mit einem automatischen biochemischen Analysegerät gemessen. Vier Indikatoren (HA, LN, PIIINP und IV-C) der Serumleberfibrose wurden mit einem ELISA-Kit analysiert. Lebergewebe wurden präpariert und zur anschließenden histologischen Analyse in 10 % Formalin gelagert. Ein Teil der Leber wurde für die anschließende Western-Blot-Analyse in flüssigem Stickstoff gelagert.

Die H2O2-Anreicherung wurde mit einem H2O2-Assay-Kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China) bestimmt. Schockgefrorenes Lebergewebe wurde mit Kochsalzlösung homogenisiert. Anschließend wurde die H2O2-Konzentration gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Die In-vitro-Zytotoxizitätsbewertung von MnO2@PLGA/Ssb1, PLGA/Ssb1 und Ssb1 wurde mittels MTT-Assay durchgeführt. HSC-T6- und LX-2-Zellen wurden auf 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen pro Well ausgesät und in 100 µL Medium, ergänzt mit 10 % (v/v) FBS, gezüchtet. Nach 24 Stunden bei 37 °C wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden 24 Stunden lang mit 200 µL frischem Medium, das verschiedene Konzentrationen von PLGA/Ssb1@MnO2, PLGA/Ssb1 oder freier Ssb1-Lösung enthielt, inkubiert. Dann wurden 20 µL MTT-Lösung (5 mg/ml) in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer weiteren 4-stündigen Inkubation bei 37 °C. Schließlich wurde das MTT enthaltende Medium entfernt und 150 µL DMSO hinzugefügt, um die Formazankristalle aufzulösen. OD570 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Synergy H1, Biotek, USA) gemessen. Alle Experimente wurden in vierfacher Ausführung durchgeführt. Als Kontrolle dienten unbehandelte Zellen.

Die akute Toxizität wurde bewertet, um die biologische Sicherheit des Nanosystems sicherzustellen. Balb/c-Mäuse wurden jeweils in fünf Gruppen eingeteilt (n = 5): PBS (unbehandelt), Ssb1, MnO2, PLGA/Ssb1 und MnO2@PLGA/Ssb1. Mäusen in allen Gruppen wurden an drei aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich unterschiedliche Lösungen (0,1 ml; einschließlich einer äquivalenten Ssb1-Konzentration von 1,65 mg/ml) lokal intravenös injiziert. 24 Stunden nach der letzten Injektion wurden die Mäuse getötet und die Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere) präpariert und für die anschließende H&E-Färbung in 10 % Paraformaldehyd gelagert. Es wurde Blut gesammelt und auf AST, ALT und ALP analysiert, um die akute Toxizität in vivo zu beurteilen.

Die Gesamtproteine ​​wurden aus den Zellen extrahiert, indem ein RIPA-Puffer (R0010, Solarbio) verwendet wurde, der mit Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF, 8553, CST) ergänzt war. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA Protein Assay Kit (P0011, Beyotime) gemessen. Das Protein wurde auf ein SDS-PAGE-Gel (Natriumdodecyl-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) geladen und durch Elektroblotting auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen (IPVH00010 Merck Millipore, Billerica, MA, USA) übertragen. Die Membranen wurden durch einstündiges Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) in PBS-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 und 5 % Magermilch blockiert. Anschließend wurden sie zunächst mit den entsprechenden Primärantikörpern inkubiert: a-SMA (1:1000, 14395-1-AP, Proteintech), CAT (1:2000, 21260-1-AP, Proteintech), HIF-1α (1:1000). , AF1009, Affinity), Caspase-3 p12 (1:1000, ab179517, Abcam), TGF-β1 (1:1000, ab215715, Abcam), Kollagen I (1:1000, 14695-1-AP, Proteintech), Kollagen I (1:1000, ab34710, Abcam) GAPDH (1:5000, AF1186, Beyotime), α-Tubulin (1:5000, 11224-1-AP, Proteintech), Foxo3a (1:1000, AF7624, Affinity), CAT (1:2000, 66765-1-Ig), Nrf2 (1:1000, 16396-1-AP) und β-Actin (1:5000, 66009-1-Ig) in primärem Antikörperverdünnungsmittel (P0023A, Beyotime) bei 4 °C über Nacht. Anschließend wurden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit HRP-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG- (1:5000, ab97051, Abcam) oder Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörpern (1:5000, BA1050, Boster) inkubiert. Immunreaktive Banden wurden mit dem ChemiDoc™ Touch-Bildsystem (ChemiDoc™ Touch, Bio-Rad, CA, USA) sichtbar gemacht. In einigen Experimenten wurden der vorherige Primärantikörper und der Sekundärantikörper mit Stripping-Puffer (SW3022, Solarbio) 30 Minuten lang von der PVDF-Membran entfernt. Nach der erneuten Blockierung wurde die Membran über Nacht bei 4 °C mit einem anderen Primärantikörper erneut inkubiert. Die folgenden Schritte waren die gleichen wie oben beschrieben. Densitometrisch quantifiziert mit der ImageJ-Software und die Proteinexpressionsniveaus wurden gegen GAPDH normalisiert.

Lebergewebe wurde in 10 % Formalin eingeweicht und in Paraffin eingebettet. Die gewonnenen Gewebe wurden vorbehandelt, dehydriert und in Paraffin eingebettet. In Paraffin eingebettetes Lebergewebe wurde in 4 µm-Schnitte geschnitten. Nach der Entparaffinierung und Hydratation wurden die Schnitte gefärbt. H&E wurde entsprechend der Organisationsstruktur für pathologische Beurteilungen eingesetzt. Zur Beurteilung der Kollagene wurde die Masson-Färbung eingesetzt. Mit einem Mikroskop (ZEISS Axio Vert. A1) wurden in zufälligen Feldern Fotos dieser gefärbten Schnitte gemacht.

Alle Tests wurden mehr als dreimal wiederholt, um sicherzustellen, dass alle Ergebnisse korrekt waren. Die quantitativen Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt und zum Vergleich zweier Gruppen mit dem Student-t-Test bzw. dem Mann-Whitney-U-Test analysiert. Alle Diagramme wurden mit der Software GraphPad Prism 8 Version erstellt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant erkannt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen Zusatzinformationsdateien (Ergänzungsinformationen und Zusatzdaten 1–3) oder auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die Transkriptomsequenzdaten wurden an die Sequence Read Archive (SRA)-Datenbanken unter der BioProject-Nummer PRJNA916271 übermittelt.

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Wir danken Dr. Tao Su für die Unterstützung der Rattenleber-Sternzelllinie HSC-T6. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 52003246, 81922073 und 81973481) finanziell unterstützt; das Projekt des Schlüsselforschungsfonds für traditionelle chinesische Medizin der Provinz Zhejiang (Nr. 2018ZY004, 2022ZQ032 und 2021ZZ009); und das Youth Natural Science Program der Zhejiang Chinese Medical University (2021JKZKTS007A).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Mengyun Peng, Meiyu Shao.

School of Pharmacy, Zhejiang Chinese Medical University, 310053, Hangzhou, VR China

Mengyun Peng, Meiyu Shao, Hongyan Dong, Xin Han, Min Hao, Qiao Yang, Qiang Lyu, Kuilong Wang, Haodan Kuang und Gang Cao

Abteilung für Wissenschaft und Bildung, Das erste angegliederte Krankenhaus der Guiyang University of Chinese Medicine, 550001, Guiyang, China

Dongxin Tang

Abteilung für Gastroenterologie, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 310003, Hangzhou, China

Zhe Shen

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MP und GC konzipierten die Studie und alle Autoren waren an der Versuchsgestaltung beteiligt. QL, MH und KW waren für die HPLC- und LC-MS-Experimente verantwortlich. MS, HD und XH verwalteten In-vitro-Experimente. QY unterstützte die Konstruktion von Tiermodellen und die intravenöse Injektion. HK leistete professionelle Hilfe. DT und ZS stellten klinische Proben zur Verfügung. MP und MS haben dieses Manuskript geschrieben und GC hat das Manuskript überarbeitet.

Korrespondenz mit Gang Cao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Robert DeLong und Joao Valente. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Peng, M., Shao, M., Dong, H. et al. Nanodrug rettet Leberfibrose durch synergistische Therapie mit H2O2-Abbau und verzögerter Freisetzung von Saikosaponin b1. Commun Biol 6, 184 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04473-2

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Eingegangen: 13. Juni 2022

Angenommen: 11. Januar 2023

Veröffentlicht: 16. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04473-2

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