Die Neuverkabelung des Glukosestoffwechsels verbessert sich 5

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1159 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Trotz der Tatsache, dass 5-Fluorouracil (5-FU) das Rückgrat der Chemotherapie bei Darmkrebs (CRC) ist, sind die Ansprechraten bei Patienten auf 50 % begrenzt. Die Mechanismen, die der 5-FU-Toxizität zugrunde liegen, werden diskutiert, was die Entwicklung von Strategien zur Verbesserung seiner Wirksamkeit einschränkt. Wie grundlegende Aspekte von Krebs, wie Treibermutationen und phänotypische Heterogenität, mit der 5-FU-Reaktion zusammenhängen, bleibt unklar. Dies beruht weitgehend auf der begrenzten Anzahl von Studien, die in präklinischen Modellen durchgeführt wurden und in der Lage sind, die Hauptmerkmale von CRC zu rekapitulieren. Hier analysierten wir die 5-FU-Reaktion in von Patienten stammenden Organoiden, die die verschiedenen Stadien des Darmkrebses reproduzieren. Wir stellen fest, dass 5-FU ein Pyrimidin-Ungleichgewicht induziert, das zu DNA-Schäden und Zelltod in den aktiv proliferierenden Krebszellen mit p53-Mangel führt. Wichtig ist, dass ein p53-Mangel zum Zelltod aufgrund eines beeinträchtigten Zellzyklusstopps führt. Darüber hinaus stellen wir fest, dass die gezielte Nutzung des Warburg-Effekts in glykolytischen Tumororganoiden vom Typ KRASG12D die 5-FU-Toxizität erhöht, indem der Nukleotidpool weiter verändert wird, ohne dass dies Auswirkungen auf nicht transformierte WT-Zellen hat. Somit erweist sich p53 als wichtiger Faktor bei der Bestimmung der 5-FU-Reaktion, und die gezielte Behandlung des Krebsstoffwechsels in Kombination mit Replikationsstress-induzierenden Chemotherapien erweist sich als vielversprechende Strategie für die CRC-Behandlung.

Weltweit ist Darmkrebs (CRC) die dritthäufigste Krebsart und die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache1. Bei Patienten mit Darmkrebs im Frühstadium oder mit resektablen Metastasen ist die Operation derzeit nach wie vor die einzige kurative Behandlung. CRC-Patienten erhalten zusätzlich eine adjuvante Chemotherapie und Patienten mit inoperablem, metastasiertem CRC sind vollständig auf Chemotherapie angewiesen2. Obwohl auf 5-FU basierende Chemotherapien ein schlechtes Tumoransprechen zeigen (Raten von bis zu 50 %)3,4,5 und das krankheitsfreie Überleben nicht effektiv verlängern2,3,4,6,7, bleibt es die häufigste Behandlung für Darmkrebs (rezensiert in8). Darüber hinaus bleibt unklar, für welche Patienten eine 5-FU-Therapie von Nutzen ist.

Trotz der Bedeutung von 5-FU wird der zugrunde liegende Mechanismus seiner Toxizität immer noch diskutiert. Bei der zellulären Aufnahme wird 5-FU in aktive fluorierte Metaboliten umgewandelt. 5-FUTP und 5-FdUTP können in RNA bzw. DNA eingebaut werden, und F-dUMP kann die Thymidylatsynthase (TS) hemmen, wodurch der Desoxynukleotidpool und folglich die DNA-Replikation und -Reparatur beeinträchtigt werden (Übersicht in Lit. 8,9). Wie sich dies bei Patienten niederschlägt, bleibt unklar, obwohl eine Reihe von Studien zeigen, dass 5-FU durch den Einbau von F-UTP in RNA Zytotoxizität induzieren kann10,11,12,13,14. Andererseits scheint die TS-Expression im Tumor mit der 5-FU-Reaktion zu korrelieren, was darauf hindeutet, dass die Toxizität von 5-FU auf einer beeinträchtigten DNA-Replikation und/oder -Reparatur beruhen könnte, eine Korrelation bedeutet jedoch keinen ursächlichen Zusammenhang8,15,16,17 ,18.

Obwohl Präzisionsmedizin und die Anwendung gezielter Therapien durch Genomstudien erleichtert wurden, war dies bei konventionellen Chemotherapien relativ erfolglos2,19. Die Relevanz verschiedener genetischer Mutationen für die Bestimmung der 5-FU-Reaktion ist tatsächlich immer noch unklar. Darüber hinaus tragen genetische und phänotypische Heterogenität innerhalb des Tumors auch zum unterschiedlichen Therapieansprechen und zur unterschiedlichen Resistenz bei2,20,21,22. Krebsstammzellen (CSCs) sind eine solche Untergruppe von Tumorzellen innerhalb des Tumors, die sich aktiv vermehren und ein Differenzierungspotenzial aufweisen23,24,25. Ob verschiedene CRC-Zelltypen unterschiedlich auf 5-FU reagieren, muss ebenfalls noch geklärt werden. Insgesamt besteht immer noch ein Wissensdefizit, der einer Verbesserung von 5-FU-basierten CRC-Behandlungsstrategien Grenzen setzt.

Studien, die darauf abzielen, unser Wissen über die Wirkmechanismen konventioneller Chemotherapien zu erweitern, sollten in präklinischen Modellen durchgeführt werden, die eine Manipulation ermöglichen, aber gleichzeitig die morphologischen und molekularen Eigenschaften von Darmkrebs-Tumoren rekapitulieren. Von Tumoren abgeleitete 2D-Zelllinien haben wesentlich zum aktuellen Verständnis der Krebsbiologie beigetragen, weisen jedoch in den meisten Fällen eine geringe (genetische) Stabilität auf und es fehlt ihnen die zelluläre Heterogenität von Tumoren in vivo26. Im Gegensatz dazu sind Tumorbiopsien, die alle Merkmale des Tumors aufweisen, aufgrund des begrenzten Materials und fehlender Manipulationsmöglichkeiten oft nicht für die Untersuchung geeignet. Von Patienten stammende Organoide (PDOs) schließen die Lücke zwischen Patientenbiopsien und 2D-Zelllinien. PDOs rekapitulieren Variationen der somatischen Kopienzahl und Mutationsspektren, die in CRC-Tumoren gefunden werden, sowie die genetische und nichtgenetische Heterogenität von CRC-Tumoren27,28. Darüber hinaus haben mehrere Studien gezeigt, dass aus Tumoren gewonnene Organoide verschiedener Krebsarten das Ansprechen auf eine Chemotherapie bei Patienten vorhersagen29,30,31,32,33 und dass das Ansprechen über die Zeit stabil ist32,34. Darüber hinaus ermöglichen Organoide Manipulationen zur Beurteilung der Kausalität und der Mechanismen, die der Arzneimitteltoxizität nachgeschaltet sind.

Tumore haben einen komplexen genetischen Hintergrund und nicht alle genetischen Läsionen sind Treiber für das Fortschreiten des Tumors und bestimmen auch nicht das Ansprechen auf die Therapie2,35,36. Um die spezifischen Mutationen zu identifizieren, die das Ansprechen auf eine Chemotherapie bestimmen, haben wir ein klar definiertes System gewählt, das CRC Tumor Progression Organoid Model (TPO)37 und PDOs. Das TPO-Modell besteht aus Organoiden, die aus gesundem Dickdarmgewebe stammen und gentechnisch so verändert wurden, dass sie die vier häufigsten Treibermutationen von CRC (APCKO, KRASG12D, P53KO, SMAD4KO) beherbergen. PDOs stammen direkt aus Tumoren des Patienten und wurden bereits charakterisiert27. Hier zeigen wir, dass ein p53-Mangel bei 5-FU-Behandlung sowohl bei TPOs als auch bei PDOs durchgängig DNA-Schäden und Zelltod hervorruft. Dies liegt daran, dass p53-defiziente Zellen nicht in der Lage sind, die Zellproliferation zu stoppen. Aktives p53 schützt vor 5-FU-induzierten DNA-Schäden, indem es einen G1-Arrest in nicht transformierten WT- und AK-Organoiden (APCKO, KRASG12D) induziert, was zum Überleben führt. Bei PDOs beobachten wir eine variablere Reaktion; Obwohl p53 einen Zellzyklusstopp induziert und vor 5-FU-induzierten DNA-Schäden schützt, kann es zusätzlich eine schnelle apoptotische Reaktion hervorrufen. Diese unterschiedliche Reaktion auf p53 ist wahrscheinlich auf ein komplexes Zusammenspiel von p53 mit den zahlreichen zusätzlichen genetischen Läsionen zurückzuführen, die in PDOs vorhanden sind. Da wir herausgefunden haben, dass die Wirkungsweise von 5-FU auf einem Pyrimidin-Ungleichgewicht beruht, haben wir auf den Stoffwechsel von Krebszellen gezielt, um die Wirksamkeit des Antimetaboliten 5-FU zu verbessern. Bemerkenswert ist, dass wir herausgefunden haben, dass die Neuverdrahtung des Warburg-Effekts den Nukleotidspiegel senkt und die 5-FU-Toxizität selektiv in p53-defizienten und KRASG12D-glykolytischen CRC-Zellen erhöht, jedoch nicht in nicht transformierten Darmzellen.

Um spezifische Mutationen mit der 5-FU-Empfindlichkeit bei CRC zu verknüpfen, haben wir die 5-FU-Reaktion in TPOs analysiert, die gentechnisch so verändert sind, dass sie verschiedene Kombinationen der wichtigsten CRC-Treiber beherbergen. Wir verwendeten in dieser Studie nicht transformierte (WT), APCKOKRASG12D (AK), APCKOP53KO (AP), APCKOKRASG12DP53KO (APK) und APCKOKRASG12DP53KOSMAD4KO (APKS)37 TPOs. Dieses Modell wurde in vitro und in vivo untersucht, und APK- und APKS-Organoide rekapitulieren die morphologischen Merkmale von Adenokarzinomen bzw. schlecht differenzierten Adenokarzinomen mit Metastasierungspotenzial37,38. Zunächst analysierten wir die Empfindlichkeit gegenüber der 5-FU-Behandlung und stellten fest, dass die Reaktion bei den verschiedenen Organoidlinien unterschiedlich war. 5-FU reduzierte die Lebensfähigkeit der Zellen in AP-, APK- und APKS-Organoiden deutlich, die auch höhere Wachstumsraten aufwiesen als WT- und AK-Organoide. Im Gegensatz dazu zeigten WT- und AK-Organoide keine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen, obwohl Unterschiede in der Organoidgröße beobachtet wurden, was auf eine zytostatische Wirkung von 5-FU schließen lässt (Abb. 1a, b und ergänzende Abb. 1a – d). P53 ist ein gut etablierter Faktor und Bestandteil der DNA-Schadensreaktion und 5-FU kann die DNA-Synthese beeinträchtigen8,9,39. Daher haben wir den DNA-Schadensmarker γH2AX auf 5-FU untersucht. Western-Blot- und Durchflusszytometrieanalysen zeigten, dass die 5-FU-Behandlung DNA-Schäden in den p53-defizienten Organoiden hervorrief, wohingegen dieser Phänotyp in den WT- und AK-Organoiden milder und/oder nicht signifikant war (Abb. 1c, d und ergänzende Abb. 1d). , e). Um weitere Einblicke in den 5-FU-induzierten DNA-Schaden zu gewinnen, haben wir die Aktivierung der verschiedenen DNA-Schadensreaktionswege analysiert. Blockierte Replikationsgabeln und einzelsträngige DNA-Brüche sind häufige Folgen konventioneller Chemotherapien40,41. Daher haben wir zunächst den ATR-Chk1-Signalweg untersucht, der bei Replikationsstress und Einzelstrangbrüchen aktiviert wird42. Zeitverlaufsexperimente ergaben, dass 5-FU die Chk1-Aktivierung sowohl in WT- als auch in p53-defizienten Organoiden bereits nach 24 Stunden induziert (ergänzende Abbildung 1e). Nach 24 Stunden zeigten WT-Organoide eine leichte Induktion des DNA-Schadensmarkers γH2AX. P53WT-Organoide beseitigten den Schaden innerhalb der nächsten 24 Stunden, während p53-defiziente Organoide zu diesem späteren Zeitpunkt eine Anreicherung von γH2AX zeigten (ergänzende Abbildung 1e). Dies deutet darauf hin, dass P53WT-Zellen zwar 5-FU-induzierte DNA-Schäden beheben, p53-defiziente Organoide dies jedoch nicht tun. Interessanterweise verhindert die Hemmung von ATR die Chk1-Aktivierung sowohl in transformierten als auch in WT-Organoiden, was darauf hindeutet, dass die Chk1-Aktivierung ein Ergebnis von Replikationsstress ist (Abb. 1e)43. Dementsprechend erhöht die Hemmung des ATR-Chk1-Signalwegs die γH2AX-Spiegel sowohl in WT- als auch in AKPS-Organoiden (Abb. 1f). Bei Replikationsstress können nicht reparierte blockierte Replikationsgabeln zu doppelsträngigen DNA-Brüchen und zur Aktivierung des ATM-Chk2-Signalwegs führen42,44. Wir fanden heraus, dass 5-FU zu einer ATM-abhängigen Aktivierung von Chk2 in APK und APKS führt, nicht jedoch in WT-, AK- und AP-Organoiden (Abb. 1e und ergänzende Abb. 1e)45. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass der ATR-Chk1-Signalweg für die Auflösung des durch 5-FU induzierten Replikationsstresses erforderlich ist und, was noch wichtiger ist, dass die 5-FU-Behandlung zu einem erhöhten Maß an ungelösten DNA-Schäden und Zelltod in p53-defizienten Tumororganoiden führt.

a Repräsentative Hellfeldbilder von WT- und CRC-Organoiden, die 7 Tage lang mit 5-FU behandelt wurden (Maßstabsbalken = 500 µm). b Zelllebensfähigkeitsanalyse von WT- und CRC-Tumororganoiden mittels Durchflusszytometrie zur Unterscheidung lebender (DAPI−) von toten Zellen (DAPI+) nach 7 Tagen 5-FU-Behandlung (Mittelwert ± SEM, n = 3–5, einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). c Western-Blot-Nachweis von γH2AX und β-Actin in Lysaten von WT- und CRC-Tumororganoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (repräsentativ für n = 5). WT, AK, AP, APK, APKS wurden zusammen auf demselben Gel laufen gelassen. d Quantifizierung von Zellen mit DNA-Schäden durch Durchflusszytometrie von WT- und CRC-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt und mit Anti-γH2AX gefärbt wurden (Mittelwert ± SEM, n = 5 (WT), 3 (AK), 6 (AP) , 8 (APK und APKS), einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). e, f Western-Blot-Nachweis von (p)Chk1, (p)Chk2, γH2AX und Vinculin von Lysaten aus WT- und APKS-Organoiden, die 24 Stunden lang mit 5-FU behandelt und gleichzeitig entweder mit dem ATR-Inhibitor VE-821 oder dem ATM-Inhibitor KU55933 behandelt wurden oder beides für 26 Stunden (repräsentativ für n = 3, WT: Chk2: Santa Cruz, #SC-9064, APKS: Chk2: Cell Signaling, #3440). WT und APKS wurden auf getrennten Gelen durchgeführt. ns: nicht signifikant, *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001.

Unsere oben genannten Ergebnisse zeigen, dass nicht alle Zellen gleichmäßig auf die Behandlung reagieren, da ein Teil der Zellen keine DNA-Schäden aufweist und die Behandlung überlebt (Abb. 1b, d). Um die 5-FU-Reaktion auf Einzelzellebene zu analysieren, haben wir dies weiter an den auf 5-FU reagierenden Organoiden (AP, APK und APKS) untersucht. Wir analysierten zunächst den 5-FU-induzierten DNA-Schaden mittels Immunfluoreszenz und untersuchten die Reaktion auf Einzelzellebene. Tatsächlich ist der 5-FU-induzierte DNA-Schaden innerhalb einzelner Organoide zwischen den Zellen heterogen (Abb. 2a und ergänzende Abb. 2a). Neben der genetischen Heterogenität weisen CRC-Tumoren auch eine phänotypische Heterogenität auf. Ähnlich wie der gesunde Darm zeichnen sich Krebsstammzellen (CSCs) durch eine hohe Wnt-Signalübertragung aus, vermehren sich und fördern das Tumorwachstum23,24,25,46,47. Um die Reaktion auf 5-FU in CSCs zu untersuchen, haben wir den Wnt-basierten Stammzellreporter STAR48,49,50,51 genetisch in unsere Organoidlinien eingeführt. Sowohl in WT- als auch in CRC-Organoiden zeigten die Zellen eine Heterogenität im Stammzustand (Abb. 2b und ergänzende Abb. 2b). Darüber hinaus zeigten EdU-Inkorporations- und Zellzyklusanalysen, dass STAR+-Zellen sowohl in WT- als auch in CRC-Organoiden tatsächlich die proliferierende Zellpopulation darstellen (ergänzende Abbildung 2c – e) 23, 24. Interessanterweise ergaben Durchflusszytometrie- und Immunfärbungsanalysen, dass CSCs bei der 5-FU-Behandlung mehr DNA-Schäden erleiden als differenzierte Zellen (Abb. 2c, d und ergänzende Abb. 2c, f), was mit ihrer hohen Proliferationsrate zusammenhängt. Dementsprechend ergab die Immunfärbung des proliferativen Markers Ki67 in Kombination mit γH2AX, dass Ki67+-proliferierende Zellen bei 5-FU mehr DNA-Schäden aufweisen als nicht-proliferierende Ki67--Zellen (Abb. 2e und ergänzende Abb. 2g). Darüber hinaus zeigte die Analyse von γH2AX in jeder Zellzyklusphase, dass der Anteil DNA-geschädigter Zellen in der S- und G2/M-Phase höher ist als bei Zellen in G1 (Abb. 2f). Interessanterweise findet sich dieses bei zyklischen CSCs beobachtete Muster auch in (einem kleinen Anteil) zyklischer STAR-differenzierter Zellen (ergänzende Abbildung 2h). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass ein aktiver Proliferationszustand in den Zellen entscheidend für die 5-FU-Empfindlichkeit ist.

a Repräsentative Bilder von APKS-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt und mit Anti-γH2AX und DAPI gefärbt wurden (Maßstabsbalken = 50 µm). b Repräsentative Bilder von APKS-Organoiden, die mit dem Stammzellreporter STAR transduziert und mit DAPI gefärbt wurden (Maßstabsbalken = 50 µm, oberes Feld: einzelner Z-Stapel, unteres Feld: maximale Projektion von Z-Stapeln). c Quantifizierung der γH2AX-Intensität in STAR−- und STAR+-Zellen von Immunfluoreszenzbildern von AP-, APK- und APKS-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (ergänzende Abbildung 2f) (70–153 Zellen pro Zustand aus 12 Organoiden aus drei unabhängigen Experimenten , Mann-Whitney-Test). d Nachweis von γH2AX+-Zellen mittels Durchflusszytometrie in STAR- vs. STAR+-Zellen von AP-, APK- und APKS-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (Mittelwert ± SEM, n = 6 (AP, APKS), 7(APKS), ein- Weg-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). e Quantifizierung der γH2AX-Intensität in KI67+ vs. KI67- Zellen von Immunfluoreszenzbildern von AP-, APK- und APKS-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (ergänzende Abbildung 2G) 128–331 Zellen pro Zustand aus 12 Organoiden aus drei unabhängigen Experimenten, Mann-Whitney-Test). f Nachweis von γH2AX+-Zellen mittels Durchflusszytometrie G1-, S- und G2/M-Zellen von AP-, APK- und APKS-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (Mittelwert ± SEM, n = 5 (AP), 7 (APK, APKS), AP, APK: einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest, APKS: Kruskal-Wallis-Test, Dunns Mehrfachvergleichstest. ns: nicht signifikant, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Obwohl die Bedeutung von p53 für die 5-FU-Reaktion untersucht wurde, muss sich noch ein klares Bild ergeben17,52,53,54,55. Während In-vitro-Studien zeigen, dass p53 für die 5-FU-induzierte Apoptose erforderlich ist56,57,58,59,60, zeigen epidemiologische Studien, dass die P53-Expression mit der 5-FU-Resistenz bei Patienten im Stadium III und IV korreliert52,54,61. Hier stellen wir fest, dass der Funktionsverlust von p53 zu einer 5-FU-Empfindlichkeit führt, und haben daher den Mechanismus hinter diesem Phänotyp untersucht. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass p53 und sein Transkriptionsziel p21 nach 4 bzw. 16 Stunden 5-FU-Behandlung in WT- und AK-Organoiden ansteigen (Abb. 3a). P53 reguliert die Zellproliferation über p21, das an die Cyclin/CDK-Komplexe bindet und diese hemmt, die Rb phosphorylieren, wodurch dessen Phosphorylierung und die daraus resultierende Hemmung des G1/S-Übergangs verhindert werden (Übersicht in 62). Wir fanden heraus, dass die 5-FU-Behandlung zu einem vollständigen Verlust der Rb-Phosphorylierung in P53WT-Organoiden führt, wohingegen p53-defizienten Organoiden die p21-Induktion fehlt und sie eine verbleibende Rb-Phosphorylierung aufweisen (Abb. 3b). Übereinstimmend zeigte die Analyse des Zellzyklusprofils, dass 5-FU einen G1-Arrest in P53WT-Organoiden induziert, wohingegen es in p53-defizienten Organoiden eine S/G2-Phasenakkumulation verursacht (Abb. 3c, ergänzende Abb. 1d und Tabelle 1). Dies deutet auf einen p53-induzierten G1-Arrest als Mechanismus zur Verhinderung einer 5-FU-induzierten DNA-Schädigung hin, was mit der beobachteten verringerten Größe bei WT und AK übereinstimmt (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1b, c). Um dies zu testen, haben wir die p53-Funktion ersetzt, indem wir die Zellen in G1 durch den CDK4/6-Inhibitor Palbociclib63 angehalten haben. Nach 24 Stunden Behandlung waren die meisten Zellen in G1 angehalten (ergänzende Abbildung 3a, b) und wir fuhren mit der 5-FU-Verabreichung fort. Der G1-Arrest in p53-defizienten Organoiden verhinderte die DNA-Schädigung durch 5-FU vollständig und rettete den 5-FU-induzierten Zelltod (Abb. 3d – f), was darauf hindeutet, dass die DNA-Schädigung während der Replikation der Hauptverursacher der 5-FU-Toxizität in p53 ist. mangelhafte Organoide. Um die Funktion von p53 in der 5-FU-Reaktion weiter zu validieren, führten wir bedingte P53-Add-Back-Experimente unter Verwendung eines Doxycyclin-induzierbaren P53-Überexpressionssystems (OE) durch (Abb. 3g – j und ergänzende Abb. 3c – f). Durch die Induktion von P53 wurde die 5-FU-Reaktion in APK und APKS wiederhergestellt, da die p21-Induktion wiederhergestellt und die Akkumulation des S/G2-Zellzyklus verhindert wurde (Abb. 3g, h). Dementsprechend wurden DNA-Schäden und Zelltod bei P53 OE deutlich behoben (Abb. 3g, i, j). Eine unvollständige Rettung der Zelllebensfähigkeit könnte aus dem Add-Back-System resultieren, da es die vorübergehende Stabilisierung von p53 bei 5-FU nicht rekapituliert (Abb. 3a) und eine anhaltende p53-Aktivierung zu Apoptose führen kann62,64,65. Diese Ergebnisse bestätigen, dass p53 als Unterscheidungsfaktor bei der 5-FU-Reaktion fungiert, wobei der Verlust von p53 zu 5-FU-induzierten DNA-Schäden und Zelltod führt.

ein Western-Blot-Nachweis von p53, p21 und Vinculin in WT- und AK-Organoiden, die 4, 8, 16, 24 und 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (Blot repräsentativ für n = 4). WT und AK wurden auf demselben Gel durchgeführt. b Western-Blot-Nachweis von p53, p21, (p)Rb und Vinculin in WT- und CRC-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (repräsentativ für n = 4). WT, AK, AP, APK, APKS wurden zusammen auf denselben Gelen durchgeführt. c Zellzyklusprofil bestimmt durch Durchflusszytometrie in WT- und CRC-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (Mittelwert ± SEM, n = 4 (WT), 3 (AK), 5 (AP), 7 (APK), 6 ( APKS), Kruskal-Wallis-Test, ungepaarter t-Test und Mann-Whitney-Test). d Western-Blot-Analyse von γH2AX und Tubulin von AP-, APK- und APKS-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden. Die Behandlung mit Palbociclib wurde 24 Stunden vor der 5-FU-Behandlung begonnen, um die Zellen in G1 anzuhalten (repräsentativ für n = 3). AP, APK und APKS wurden zusammen auf denselben Gelen ausgeführt. e, f Repräsentative Hellfeldbildgebung (e) und Zelllebensfähigkeitsanalyse (f) von AP-, APK- und APKS-Organoiden, die 6 Tage lang mit 5-FU behandelt wurden. Die Palbociclib-Behandlung begann 24 Stunden vor der 5-FU-Behandlung, um Zellen in G1 anzuhalten (Maßstabsbalken = 500 µm, Mittelwert ± SEM, n = 3, einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). g Western-Blot-Nachweis von p53, p21, γH2AX und β-Actin in Doxycyclin-induzierbaren APK-P53OE- und APKS-P53OE-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (Doxycyclin (40 ng/ml für APK und 200 ng/ml für). Die APKS-Behandlung wurde 16 Stunden vor der 5-FU-Verabreichung begonnen (repräsentativ für n = 3). APK und APKS wurden auf separaten Gelen ausgeführt. h Zellzyklusprofile von Doxycyclin-induzierbaren APK-P53OE- und APKS-P53OE-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (die Behandlung mit Doxycyclin (40 ng/ml für APK und 200 ng/ml für APKS) wurde 16 Stunden vor 5-FU begonnen). Verabreichung) (Mittelwert ± SEM, n = 3, einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). i, j Hellfeldbilder (i) und Zelllebensfähigkeitsanalyse (j) von Doxycyclin-induzierbaren APK-P53OE- und APKS-P53OE-Organoiden mittels Durchflusszytometrie zur Unterscheidung lebender (DAPI−) von toten (DAPI+) Zellen nach 4 Tagen 5-FU Behandlung. APK: Die Behandlung mit Doxycyclin (40 ng/ml) wurde 16 Stunden vor der 5-FU-Verabreichung begonnen und 24 Stunden nach der Verabreichung ausgewaschen. APKS: Die Behandlung mit Doxycyclin (200 ng/ml) wurde 16 Stunden vor der Verabreichung von 5-FU begonnen und wurde nicht weggespült (Maßstabsbalken = 500 µm, Mittelwert ± SEM, n = 6 (APK-P53 OE), 4 (APKS-P53). OE), einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). ns: nicht signifikant, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Als nächstes fragten wir, ob dieser Mechanismus in einem Modell erhalten bleibt, das näher an den CRC-Patienten liegt. Daher haben wir die 5-FU-Reaktion in Organoiden untersucht, die aus Tumoren von CRC-Patienten (PDOs) stammen27. Wir haben Linien mit oder ohne Mutationen in P53 ausgewählt und die p53-Funktion anhand der Empfindlichkeit gegenüber MDM2-Hemmung (Nutlin-3) validiert (ergänzende Abbildung 4a). Nutlin-3 induzierte den Zelltod in P7t- und P14t-Organoiden, während P9t, P16t und P19bt resistent waren, was auf funktionelles bzw. nicht funktionelles p53 hinweist (ergänzende Abbildung 4a). Bei der 5-FU-Behandlung reagierten die p53-defizienten Linien P9t, P16t, P19bt ähnlich wie das TPO-Modell, da sie keinen p21- und G1-Arrest induzieren konnten und DNA-Schäden und Zelltod erlitten (Abb. 4a – e und ergänzende Abb. 1d). In PDO-Linien mit funktionellem p53 (P7t und P14t) beobachteten wir, dass 5-FU tatsächlich die p53-Stabilisierung, die p21-Induktion und den G1-Arrest induziert (ergänzende Abbildung 4b, c). Diese PDOs erlebten jedoch schnell einen apoptotischen Zelltod ohne eindeutige Anzeichen einer DNA-Schädigung (ergänzende Abbildung 4b, d, e). Im Gegensatz zu TPOs weisen die PDOs im Vergleich zu den TPOs eine beträchtliche Anzahl zusätzlicher genetischer Läsionen auf. Dies weist darauf hin, dass bei Vorliegen dieser zusätzlichen spezifischen tumorintrinsischen Zustände, wie z. B. hohe p53-Grundwerte in P14t (ergänzende Abbildung 4b) oder der hypermutierte Zustand von P7t27, die p53-Funktion von der Vermittlung von Resistenz zur Auslösung von Apoptose abweichen kann. Um die Funktion von p53 in PDOs weiter zu untersuchen, haben wir das p53-Add-Back-System in Linien mit p53-Mangel eingeführt (ergänzende Abbildung 4f). Die Wiedereinführung von P53 in p19bt und p16t stellte die p21-Induktion wieder her, verhinderte die Akkumulation des S/G2-Zellzyklus und verhinderte wirksam DNA-Schäden bei der 5-FU-Behandlung (Abb. 4f, g und ergänzende Abb. 4f). P53 OE rettete eindeutig die Lebensfähigkeit in P19bt und leicht in p16t-Organoiden (Abb. 4h, i). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Funktionsverlust von p53 in Tumoren ein konsistentes Ergebnis hat, das durch DNA-Schäden verursachten Zelltod gekennzeichnet ist. In P53WT-Tumoren induziert 5-FU die p53-Aktivierung, die p21-Induktion und den G1-Arrest. Abhängig von den zusätzlichen Tumor-intrinsischen Bedingungen kann p53 Apoptose unabhängig von der DNA-Schädigung entweder schützen oder induzieren.

ein Western-Blot-Nachweis von p53, p21 und Tubulin in WT- und P9t-, P16t- und P19bt-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (repräsentativ für n = 3). WT, P9t, P16t und P19bt wurden zusammen auf denselben Gelen durchgeführt. b Quantifizierung von Zellen mit DNA-Schaden durch Durchflusszytometrie von P9t-, P16t- und P19bt-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt und mit Anti-γH2AX gefärbt wurden (Mittelwert ± SEM, n = 6 (P9t), 3 (P16t), 4 ( P19bt), einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). c Analyse des Zellzyklusprofils mittels Durchflusszytometrie von P9t-, P16t- und P19bt-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt und mit DAPI gefärbt wurden (Mittelwert ± SEM, n = 6 (P9t), 3 (P16t), 4 (P19bt) 4 , P9t und P16t: ungepaarter t-Test, P19bt: Mann-Whitney-Test). d, e Hellfeldbilder (d) und Zelllebensfähigkeitsanalyse (e) von P9t-, P16t- und P19bt-Organoiden, die 6 Tage lang mit 5-FU behandelt wurden (Maßstabsbalken = 500 µm, Mittelwert ± SEM, n = 5 (P9t), 8 (P16t), 4 (P19bt) 4, einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). f, g Western-Blot-Nachweis von p53, p21, γH2AX und β-Actin (f) und Analyse des Zellzyklusprofils (g) in Doxycyclin-induzierbaren P16t-P53OE- und P19bt-P53OE-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden. Die Behandlung mit Doxycyclin (200 ng/ml) wurde 16 Stunden vor der Verabreichung von 5-FU begonnen und 24 Stunden nach der Verabreichung ausgewaschen (repräsentativ für n = 3, Mittelwert ± SEM, n = 4 (P16t-P53OE), 3 (P19bt-P53OE). einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). P16t-P53OE und P19bt-P53OE wurden zusammen auf denselben Gelen laufen gelassen. h, i Hellfeldbilder (h) und Zelllebensfähigkeitsanalyse (i) von Doxycyclin-induzierbaren P16t-P53OE- und P19bt-P53OE-Organoiden, die 6 Tage lang mit 5-FU behandelt wurden. Die Behandlung mit Doxycyclin (200 ng/ml) wurde 16 Stunden vor der 5-FU-Verabreichung begonnen und 24 Stunden nach der Verabreichung ausgewaschen (Maßstabsbalken = 500 µm, Mittelwert ± SEM, n = 5, einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Der Mechanismus der 5-FU-induzierten Zytotoxizität wird immer noch diskutiert (Übersicht in Lit. 8,9). Hier fanden wir heraus, dass der 5-FU-induzierte Zelltod auf der Auslösung von DNA-Schäden in zyklischen Zellen in Organoiden ohne funktionelles p53 beruht, was auf Replikationsstress hinweist. Basierend auf der berichteten Wirkung von 5-FU auf die TS-Aktivität analysierten wir, ob 5-FU-induzierte Veränderungen im Pyrimidinpool diesen Phänotyp erklären könnten. Zunächst führten wir eine Metabolomics-Analyse von APKS-Organoiden durch, die die stärkste Reaktion auf 5-FU zeigten. Wir beobachteten, dass bei 5-FU die dUDP- und dUMP-Spiegel anstiegen, während die TDP- und TTP-Pools erschöpft waren (Abb. 5a), was darauf hindeutet, dass 5-FU die TS-Aktivität in CRC-Organoiden hemmt. Kürzlich wurde beschrieben, dass Krebszellen einen Nukleotidüberlaufmechanismus aufweisen, der eine gestörte Pyrimidinsynthese ausgleichen kann66. Dieser Nukleotidüberlaufmechanismus beinhaltet die Ausscheidung von Desoxyuridin, um die Akkumulation von dUMP zu verhindern, und die Geschwindigkeit der Desoxyuridinausscheidung hängt vom Ausmaß der TS-Hemmung ab66. Interessanterweise beobachteten wir einen Anstieg der extrazellulären Desoxyuridinspiegel bei der 5-FU-Behandlung (Abb. 5a), was die 5-FU-induzierte TS-Hemmung weiter unterstützt. Um die Bedeutung des Pyrimidin-Ungleichgewichts für DNA-Schäden und Zelltod bei 5-FU zu untersuchen, führten wir Nukleosid-Addback-Experimente durch. Die Verabreichung einer Mischung von Nukleosiden (Adenosin, Guanosin, Cytidin und Thymidin) verhinderte 5-FU-induzierte DNA-Schäden, S-Phasen-Akkumulation und Zelltod in APKS-Organoiden (Abb. 5b, c, e, f). Interessanterweise reichte die einmalige Zugabe von Thymidin, jedoch nicht der anderen Nukleoside, aus, um den 5-FU-Effekt auf Zellzyklus, DNA-Schädigung und Zelltod zu beseitigen (Abb. 5b – f). Die Verabreichung von Thymidin allein hatte keinen Einfluss auf das Fortschreiten des Zellzyklus, was zeigt, dass diese Rettung nicht von Zellzykluseffekten abhängt (Abb. 5d). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass 5-FU mechanistisch DNA-Schäden und Zelltod induziert, indem es den Pyrimidinpool in p53-defizienten Organoiden verändert.

a Nachweis von Pyrimidinen durch Metabolomik in APKS-Organoiden, die 30 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden (Mittelwert ± SEM, n = 3 technische Replikate, einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). b Western-Blot-Nachweis von γH2AX und Tubulin von APKS-Organoiden, behandelt mit 5-FU, einer Nukleosidmischung (A, G, C und T (jeweils 25 µM)) oder T (25 µM) für 48 Stunden (Blot repräsentativ für n =). 3). Alle Proben wurden auf dem gleichen Gel laufen gelassen. c Quantifizierung von Zellen mit DNA-Schäden durch Durchflusszytometrie von APKS-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU, einer Nukleosidmischung (A, G, C und T (jeweils 25 µM)) oder den einzelnen Nukleosiden (25 µM) behandelt wurden (Mittelwert). ± SEM, n = 5, 6 (5-FU), 4 (Mischung), 3 (G), einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). d Analyse des Zellzyklusprofils mittels Durchflusszytometrie von APKS-Organoiden, behandelt mit 5-FU, einer Nukleosidmischung (A, G, C und T (jeweils 25 µM)) oder T (25 µM) für 48 Stunden (Mittelwert ± SEM, n = 5 (Strg, 5-FU), 4 (+AGCT), 3 (+T), einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). e, f Repräsentative Hellfeldbilder (e) und Zelllebensfähigkeitsanalyse (f) von APKS-Organoiden, die mit 5-FU, einer Nukleosidmischung (Adenosin, Guanosin, Cytosin und Thymidin (jeweils 25 µM)) oder Thymidin (25 µM) behandelt wurden 6 Tage (Maßstabsbalken = 500 µm, Mittelwert ± SEM, n = 3, einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). A Adenosin, AU willkürliche Einheit, C Cytidin, dUDP Desoxyuridindiphosphat, dUMP Desoxyuridinmonophosphat, G Guanosin, ND nicht nachgewiesen, ns Nukleosidmischung, ns nicht signifikant, T Thymidin, TMP Thymidinmonophosphat, TDP Thymidindiphosphat, TTP Thymidintriphosphat, TS Thymidylat-Synthase. ns: nicht signifikant, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Krebszellen unterliegen dem Warburg-Effekt, indem sie unabhängig von der Sauerstoffverfügbarkeit Glukose eifrig aufnehmen und durch Glykolyse in Laktat umwandeln. Diese erhöhte Glykolyse ermöglicht eine schnelle Produktion von ATP und unterstützt die Aktivität anaboler Wege, die auf glykolytischen Zwischenprodukten wie der Nukleotidsynthese beruhen. Basierend auf der Bedeutung von Nukleotiden für die 5-FU-Toxizität kamen wir zu dem Schluss, dass die gezielte Behandlung des Warburg-Effekts die Wirksamkeit von 5-FU verbessern könnte. Die bioenergetische Analyse von Seepferdchen zeigte, dass AK-, APK- und APKS-Organoide höhere Glykolyseraten aufweisen als WT- und AP-Organoide (Abb. 6b), wohingegen sich die Atmungsparameter nicht signifikant unterscheiden (ergänzende Abb. 5a, b). Diese Ergebnisse zeigen, dass der Warburg-Effekt in In-vitro-Organoiden rekapituliert. Bemerkenswert ist, dass diese Ergebnisse eher auf die konstitutive aktive Ras-Signalübertragung (KRASG12D) als auf den p53-Funktionsverlust als Hauptursache für den Warburg-Effekt bei CRC hinweisen.

a Schematische Darstellung der Glykolyse und verschiedener Medikamente, die auf die Glykolyse abzielen. b Extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) von WT- und CRC-Organoiden, bestimmt durch einen Glykolyse-Stresstest mittels Seahorse-XF-Analyse (Mittelwert ± SEM, n = 4 (WT, AK), 5 (AP, APK, APKS), einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). c Quantifizierung von Zellen mit DNA-Schäden durch Durchflusszytometrie von APKS-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden. Die 2-DG-Behandlung begann 20 Stunden vor der 5-FU-Behandlung (Mittelwert ± SEM, n = 4, einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). d EdU-Inkorporationsanalyse mittels Durchflusszytometrie von APKS-Organoiden, die 24 Stunden lang mit 2-DG behandelt wurden (Mittelwert ± SEM, n = 5, ungepaarter t-Test). e Quantifizierung von Zellen mit DNA-Schäden mittels Durchflusszytometrie von APKS-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden. Der Glukosemangel begann 20 Stunden vor der 5-FU-Behandlung (Mittelwert ± SEM, n = 6, 5 (2 mM Glukose), einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). f EdU-Inkorporationsanalyse mittels Durchflusszytometrie von APKS-Organoiden, denen 24 Stunden lang Glukose entzogen wurde (Mittelwert ± SEM, n = 4, einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). g EdU-Inkorporationsanalyse mittels Durchflusszytometrie von WT-, APK- und APKS-Organoiden, die 24 Stunden lang mit DCA behandelt wurden (Mittelwert ± SEM, n = 4, 5 (APKS), einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). h Quantifizierung von Zellen mit DNA-Schäden durch Durchflusszytometrie von WT-, APK-, APKS- und P19bt-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden. Die DCA-Behandlung (20 mM für TPOs und 10 mM für P19bt) begann 20 Stunden vor der 5-FU-Behandlung (Mittelwert ± SEM, n = 5, 4 (WT), 6 (AK), 7 (APKS -/- und 5-FU). ), einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). i Bestimmung der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) während eines Seahorse XF-Glykolyse-Stresstests von APKS-Organoiden, die 24 Stunden lang mit DCA und TEPP-46 behandelt wurden (Mittelwert ± SEM, fünf technische Replikate, repräsentativ für n = 3). j Nachweis von TTP, dATP und ATP durch Metabolomik von APKS-Organoiden, die 24 Stunden lang mit DCA und TEPP-46 behandelt wurden (Mittelwert ± SEM, drei technische Replikate (aus wiederholten Messungen), einfache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). k Quantifizierung von Zellen mit DNA-Schäden durch Durchflusszytometrie von APKS-Organoiden, die 48 Stunden lang mit 5-FU behandelt wurden. Die DCA- und TEPP-46-Behandlungen begannen 20 Stunden vor der 5-FU-Behandlung (Mittelwert ± SEM, n = 4, 3 (DCA), einfaktorielle ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest). 2-DG 2-Desoxyglucose, ATP-Adenosintriphosphat, dATP-Desoxyadenosintriphosphat, DCA-Dichloracetat, G6P-Glukose-6-phosphat, HK-Hexokinase, PDH-Pyruvatdehydrogenase, PDK-Pyruvatdehydrogenasekinase, PEP-Phosphoenolpyruvat, PKM2-Pyruvatkinase M2, TTP-Thymidintriphosphat. ns: nicht signifikant, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Um die hohen Glykolyseraten in Tumororganoiden zu senken, verabreichten wir zunächst 2-Desoxyglucose (2-DG), ein Glukoseanalogon, das nicht metabolisiert werden kann und sich in der Zelle anreichert, was durch die Hemmung von Hexokinase-2 (HK2) zu einer verringerten Glykolyse führt; Abb. 6a; besprochen in Lit. 68). Obwohl 2-DG die Glykolyse wirksam verringerte (ergänzende Abbildung 5c), erhöhte es in Kombination mit 5-FU den durch 5-FU induzierten DNA-Schaden nicht und verringerte sogar die Wirksamkeit im Vergleich zur reinen 5-FU-Behandlung (Abb. 6c). Die EdU-Inkorporationsanalyse ergab, dass 2-DG einen starken Rückgang der Proliferation verursacht (Abb. 6d), was darauf hindeutet, dass eine gezielte Glykolyse bei gleichzeitiger Reduzierung der Proliferation den 5-FU-Effekt nicht verstärkt. Als nächstes haben wir die Glukoseverfügbarkeit gesenkt. Tatsächlich erhöhte eine begrenzte Verringerung der Glukoseverfügbarkeit vor der 5-FU-Behandlung den DNA-Schaden (Abb. 6e). Eine weitere Senkung der Glukosekonzentration verringerte jedoch die Zellproliferation und damit die Wirksamkeit von 5-FU (Abb. 6e, f). Daher suchten wir nach pharmakologischen Optionen zur Reduzierung der Glykolyse in Tumororganoiden. DCA ist ein Inhibitor der Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDK), der die Aktivität der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) und damit die Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA auf Kosten der Laktatproduktion erhöht (Abb. 6a). Die DCA-Behandlung verringerte die PDH-Phosphorylierung in allen Organoidlinien (ergänzende Abbildung 5d), was bestätigt, dass die PDK-Aktivität gehemmt wird. DCA reduzierte die hohen Glykolyseraten von Organoiden, die den Warburg-Effekt zeigen, auf Glykolyseraten, die mit denen von WT-Organoiden vergleichbar sind, und erhöhte gleichzeitig die Atmungsparameter (ergänzende Abbildung 5e – g). Wichtig ist, dass wir nach 24-stündiger DCA-Behandlung keine signifikanten Veränderungen in der Proliferation fanden (Abb. 6g). Als nächstes untersuchten wir durch Metabolomik, ob DCA den Nukleotidstoffwechsel veränderte, und stellten fest, dass die DCA-Behandlung tatsächlich die Nukleotidspiegel senkte (Abb. 6j und ergänzende Abb. 5h). Wichtig ist, dass die Verabreichung von DCA als kurze Vorbehandlung von 5-FU tatsächlich die Anzahl der Zellen erhöhte, die bei der 5-FU-Behandlung DNA-Schäden in glykolytischen APK- und APKS-Organoiden erleiden, während dies bei den weniger glykolytischen AP-Organoiden nicht beobachtet werden konnte (Abb. 6h und ergänzende Abb. 5i). Interessanterweise wurden ähnliche Ergebnisse in unseren PDO-Modellen erzielt. DCA hemmte die Glykolyse in P19bt, zeigte den Warburg-Effekt und verstärkte den 5-FU-induzierten DNA-Schaden (Abb. 6h und ergänzende Abb. 5j – l). In Übereinstimmung mit AP wurden in p16t keine zusätzlichen Effekte durch DCA-Behandlung beobachtet, da diese Linien nicht den Warburg-Effekt-Phänotyp aufweisen (ergänzende Abbildung 5j, k, m).

Als nächstes untersuchten wir, ob der synergistische Effekt von DCA auf die 5-FU-Behandlung tatsächlich auf der Hemmung der Glykolyse beruht. Proliferierende Krebszellen, die den Warburg-Effekt zeigen, exprimieren häufig die Pyruvatkinase-M2-Isoform (PKM2)69. Da PKM den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Glykolyse katalysiert, haben wir untersucht, ob TEPP-46, ein spezifischer Aktivator von PKM2, die Auswirkungen der DCA-Behandlung beheben kann (Abb. 6a)70. Zu diesem Zweck analysierten wir die Glykolyseraten von Seahorse und die intrazellulären Glukosespiegel durch Live-Bildgebung eines Glukose-FRET-Sensors71. Diese Analysen zeigten, dass die PKM2-Aktivierung die Glykolysehemmung umkehrt und den intrazellulären Glukosespiegel nach DCA-Behandlung wiederherstellt (Abb. 6i und ergänzende Abb. 5n – p). Wichtig ist, dass in Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen die TEPP-46-Behandlung die durch die DCA-Behandlung verursachte Abnahme der Nukleotide rettete und tatsächlich die additive Wirkung von DCA auf 5-FU-induzierte DNA-Schäden verhinderte (Abb. 6j, k). Insgesamt zeigt dies, dass DCA den 5-FU-induzierten DNA-Schaden verstärkt, indem es die Nukleotidspiegel als Folge der Hemmung des Warburg-Effekts senkt.

Als nächstes untersuchten wir, ob DCA in Kombination mit 5-FU den Zelltod weiter erhöhen kann. Zu diesem Zweck behandelten wir auf WT und 5-FU reagierende Organoide (APK, APKS und P19bt) mit 5-FU und 5-FU/DCA. Die qualitative Analyse zeigte, dass bei der 5-FU-Behandlung zwar einige Organoide die Behandlung überlebten, diese jedoch bei der DCA/5-FU-Behandlung fehlten (Abb. 7a und ergänzende Abb. 6a). Wir haben diesen Phänotyp in großen Mengen mittels Durchflusszytometrie und auf der Ebene einzelner Organoide quantitativ analysiert, indem wir einen Lebensfähigkeitswert auf der Grundlage einer Bildgebungsanalyse berechnet haben. In beiden Fällen stellten wir fest, dass DCA in Kombination mit 5-FU im Vergleich zur einzelnen 5-FU-Behandlung bei APK-, APKS- und P19bt-Organoiden zu einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen führt und dieser additive Effekt von DCA bei WT-Organoiden fehlte (Abb. 7a– c und ergänzende Abb. 6b, c). Als Indikator für das Überleben nach der Behandlung und das Rückfallpotenzial bewerteten wir die Auswuchskapazität nach der Behandlung. Wir behandelten Organoide mit 5-FU oder mit DCA/5-FU, entfernten die Behandlung, um eine Organoid-Wiederherstellung zu ermöglichen, und plattierten sie erneut, um die Organoidbildungskapazität zu analysieren. Wir fanden heraus, dass die DCA/5-FU-Kombination im Vergleich zur 5-FU-Behandlung sowohl bei APK- als auch bei APKS-Organoiden zu einer geringeren Anzahl gebildeter Organoide führt (Abb. 7d, e und ergänzende Abb. 6d). Die gezielte Beeinflussung des Warburg-Effekts durch Neuverdrahtung des Glukosestoffwechsels in Kombination mit 5-FU erhöht somit die DNA-Schädigung und den Zelltod in stark glykolytischen p53-defizienten Tumoren, ohne nicht transformierte Zellen zu beeinträchtigen.

a Repräsentative Hellfeldbilder von WT-, APK- und APKS-Organoiden, die 7 Tage lang mit 5-FU behandelt wurden. Die DCA-Behandlung wurde 20 Stunden vor der 5-FU-Verabreichung begonnen (Maßstabsbalken = 500 µm, Pfeilspitzen zeigen überlebende Organoide an, Sternchen zeigen beeinträchtigte Organoide an). b Repräsentative Bilder von APKS-Organoiden, gefärbt mit CYQUANT (lebend) und Hoechst (gesamt), behandelt mit 5-FU für 7 Tage. Die DCA-Behandlung begann 20 Stunden vor der 5-FU-Behandlung (Maßstabsbalken = 300 µm). c Quantifizierung des Alive-Scores von Bildern aus b und ergänzender Abbildung 6c (Median, 237–720 Organoide aus drei unabhängigen Experimenten, Kruskal-Wallis-Test, Dunns Mehrfachvergleichstest). d Repräsentative Hellfeldbilder von WT-, APK- und APKS-Organoiden 4 Tage nach der Neuplattierung nach einer 48-stündigen Behandlung mit 5-FU (50 µM) (mit oder ohne DCA-Behandlung, die 20 Stunden vor der 5-FU-Verabreichung begann), gefolgt von 7 Tage Erholungszeit (Maßstabsbalken = 200 µm). e Bestimmung lebender organoider Partikel basierend auf der ergänzenden Abbildung 6d (Mittelwert ± SEM, WT: 8 Matrigel-Tröpfchen aus zwei unabhängigen Experimenten, APK und APKS: 16 Matrigel-Tröpfchen aus 4 unabhängigen Experimenten, WT und APK: ungepaarter t-Test, APKS: Mann-Whitney-Test). ns: nicht signifikant, *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001.

Hier verwenden wir zwei Modelle menschlicher Organoide, um die Wirkungsweise von 5-FU zu analysieren und die Relevanz der verschiedenen Treibermutationen für die Bestimmung der 5-FU-Wirksamkeit bei kolorektalen Tumoren zu verstehen. Wir fanden heraus, dass Tumore, die nicht funktionierendes p53 enthalten, durch die Induktion von DNA-Schäden und dem daraus resultierenden Zelltod empfindlich gegenüber 5-FU werden. Interessanterweise hängt in diesem Modell die Wirksamkeit von 5-FU vom aktiven Proliferationszustand der Zellen ab und mechanistisch wirkt 5-FU durch Hemmung der TTP-Synthese. Um die Wirksamkeit von 5-FU bei p53-defizienten und glykolytischen Tumoren zu verbessern, haben wir den Warburg-Effekt gezielt genutzt, indem wir den Glukosestoffwechsel umgeleitet haben, um den Nukleotidpool weiter zu verändern. Diese Strategie verbesserte tatsächlich die 5-FU-Wirksamkeit bei diesen bereits empfindlichen p53-defizienten und glykolytischen Tumoren und zeigte, was noch wichtiger ist, keine zusätzliche Toxizität gegenüber gesunden, nicht transformierten Zellen.

Ziel der Präzisionsmedizin ist die Stratifizierung der Patienten für die Behandlung auf der Grundlage genetischer Veranlagungen, sodass Krebspatienten die bestmögliche Behandlung erhalten72. Bei konventionellen Chemotherapien wie 5-FU war dies jedoch erfolglos, teilweise aufgrund des ungeklärten Verständnisses der Wirkmechanismen2,19. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass 5-FU sowohl über DNA als auch über RNA Zytotoxizität induziert8,9,10,11,12,13,14,73. Diese scheinbar unterschiedliche Wirkungsweise könnte auf die 5-FU-Dosis zurückzuführen sein (in diesen Studien im Bereich von 1 bis 1000 µM), bei der hohe 5-FU-Spiegel durch RNA-Toxizität auf Zellen wirken, während dies bei längerer Exposition gegenüber niedrigen Dosen der Fall ist Es wird vermutet, dass es über durch TS-Hemmung verursachte DNA-Schäden zytotoxisch ist8,74,75,76. Bei Patienten deuten die (niedrigen) 5-FU-Konzentrationen im Plasma und in Tumoren (8 µM bzw. 45 µM/kg77) darauf hin, dass die DNA-schädigende Wirkung eher zu Toxizität bei Darmkrebstumoren führt. Dementsprechend korrelieren die TS-Expression und die 5-FU-Reaktion, wobei Tumore mit hohen TS-Werten üblicherweise resistenter gegen eine 5-FU-Therapie sind als Tumoren mit niedrigen TS-Werten8,15,16,17,18. In den CRC-Organoiden stellen wir fest, dass 5-FU bei p53-Mangel Zytotoxizität in zyklischen Zellen induziert, hauptsächlich über eine beeinträchtigte Pyrimidinsynthese-induzierte Anhäufung von DNA-Schäden. Obwohl wir in nicht zyklischen Zellen keine 5-FU-induzierte Zytotoxizität beobachtet haben, könnten unterschiedliche 5-FU-Konzentrationen oder Zeitpunkte alternative Mechanismen der 5-FU-induzierten Zytotoxizität aufdecken.

Es ist eine Herausforderung, die Rolle spezifischer Treibermutationen für die Arzneimittelwirksamkeit zu identifizieren2,35,36. Hier stellen wir fest, dass eine mangelhafte p53-Aktivität durchweg eine 5-FU-Toxizität durch durch DNA-Schäden verursachten Zelltod gewährleistet. Wenn p53 andererseits funktionsfähig ist, wird p53 stabilisiert und induziert p21, was zu einem Stillstand des Zellzyklus führt, der eine 5-FU-induzierte DNA-Schädigung verhindert. Wir stellen fest, dass diese Reaktion entweder zum Schutz vor 5-FU ausreicht und zum Überleben führt, was bei nicht transformierten WT- und AK-Organoiden beobachtet wird, oder dass sie einen schnellen apoptotischen Zelltod ohne Anzeichen einer DNA-Schädigung induziert, wie z P7t- und P14t-Organoide. Frühere Studien haben zwei Szenarien für p53 gezeigt: eine vom Zellzyklusstillstand abhängige Schutzfunktion gegen 5-FU56,78,79, aber auch, dass p53 erforderlich ist, um 5-FU-abhängige Apoptose zu induzieren14,56,57,58,59,60 . Unsere Beobachtungen deuten darauf hin, dass die p53-induzierte Apoptose wahrscheinlich unabhängig von DNA-Schäden ist und daher durch andere 5-FU-induzierte Belastungen wie RNA-Toxizität verursacht werden könnte8,9,10,11,12,13,14,73. Das Gleichgewicht zwischen p53-induziertem Stillstand des Zellzyklus und Apoptose könnte von der 5-FU-Dosis oder tumorintrinsischen Faktoren (epigenetischer Zustand, aktive Signalwege) und dem zellulären Kontext (zelluläre Mikroumgebung)80,81,82,83 oder damit zusammenhängen mit unseren Ergebnissen auf das Vorhandensein zusätzlicher Mutationen. Beispielsweise zeigt eine aktuelle Studie, dass onkogenes HRAS die p53-abhängige Transkriptionsreaktion auf Replikationsstress verringern kann84.

CSCs wurden als eine Subpopulation von Zellen innerhalb eines Tumors definiert, die über eine hohe Fähigkeit zur Tumorinitiierung verfügen. Daher wurde ursprünglich vermutet, dass CSCs für Therapieresistenz und Tumorrückfälle verantwortlich sind21. Das Auftreten einer zellulären Plastizität, durch die Nicht-CSCs einen CSC-Phänotyp annehmen können24,46, weist jedoch darauf hin, dass Therapieresistenz wahrscheinlich nicht einem bestimmten Zelltyp zugeschrieben werden kann. Bei CRC-Tumoren zeigen die meisten CSCs eine hohe Wnt-Signalisierung und aktive Proliferation23,24,25,46. Hier stellen wir fest, dass zyklische Zellen effizient von 5-FU angegriffen werden. Interessanterweise beobachteten wir in G1 eine Population von Stammzellen, die keinen DNA-Schaden anhäufen. Dies könnte im Einklang mit der zuvor berichteten Subpopulation langsam zyklischer/ruhender CSCs innerhalb der CSC-Subpopulation stehen, die eine erhöhte Resistenz und ein erhöhtes Rückfallpotenzial bei CRC-Tumoren aufweist85. Zusammengenommen unterstreichen diese Ergebnisse, dass das zelluläre Verhalten und nicht ein bestimmter Zelltyp die 5-FU-Empfindlichkeit bestimmt81.

Der Stoffwechsel von Krebszellen wird verändert, um eine unkontrollierte Proliferation zu unterstützen (Übersicht in Lit. 86, 87, 88, 89). Die Rolle des Warburg-Metabolismus (hohe Glykolyserate zu Laktat in Gegenwart von ausreichend Sauerstoff) wurde kürzlich überarbeitet und es wird vorgeschlagen, dass Laktat als Endprodukt den zellulären Redoxzustand ausgleicht, um anabole Wege zu begünstigen (Übersicht in Lit. 86, 87). DCA ist ein von der FDA zugelassenes Medikament (mit minimalen Nebenwirkungen), das derzeit zur Behandlung von Stoffwechselerkrankungen eingesetzt wird90,91. Eine frühere Studie legt nahe, dass DCA die Chemotherapie-Empfindlichkeit gegenüber Zellen mit erworbener Resistenz über einen schwer fassbaren Stoffwechselmechanismus wiederherstellen könnte92,93. Hier zeigen wir, dass es bei einer kurzen Vorbehandlung mit 5-FU den Glukosestoffwechsel verändert und die Wirksamkeit verbessert. DCA kann diesen additiven Effekt nur in Organoiden induzieren, die sowohl einen Verlust von funktionellem p53 als auch den Warburg-Effekt zeigen. Unsere Ergebnisse und frühere Beweise94 legen nahe, dass die KRASG12D-Mutation und nicht der p53-Funktionsverlust zu den Stoffwechselveränderungen führt, die als Warburg-Effekt bei CRC bezeichnet werden. Dies deutet auf eine Untergruppe von Tumoren hin, die von dieser Behandlungskombination profitieren könnten. Mechanistisch zeigen wir, dass DCA die Wirksamkeit von 5-FU verbessert, indem es die Nukleotidspiegel als Folge der Hemmung des Warburg-Effekts senkt, ohne Zytostase zu induzieren. Dies ist ein zusätzlicher Mechanismus zu den zuvor bei längerer DCA-Behandlung beobachteten verringerten Wachstumsraten92, der auf Unterschiede in den Proliferations- und Differenzierungsprozessen nach den Stoffwechselübergängen zurückzuführen sein könnte95,96. Basierend auf dieser Wirkung von DCA schlagen wir vor, dass die Neuverdrahtung des Glukosestoffwechsels wahrscheinlich auch die Wirksamkeit anderer Chemotherapien verbessert, die auf die DNA-Replikation abzielen.

Während die Präzisionsmedizin Fortschritte macht, sind konventionelle Chemotherapien immer noch das Arbeitspferd der Onkologie. Ein besseres Verständnis ihrer Wirkungsweise ist der Schlüssel zur Entwicklung kostengünstiger und toxizitätsarmer Strategien zur Verbesserung der Patientenbehandlung. Wenn man bedenkt, dass die Umschaltung des Glukosestoffwechsels offenbar keine negativen Auswirkungen auf gesundes Gewebe hat, erweist sie sich als vielversprechende Strategie zur Verbesserung konventioneller Chemotherapien.

Organoide zur Tumorprogression waren ein Geschenk des Clevers-Labors37. Von Patienten stammende Organoide P7t, P9t, P14bt, P16t und P19bt wurden aus der HUB-Biobank bezogen und zuvor charakterisiert27. Organoide wurden bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Der Status Mykoplasmenfreiheit wurde routinemäßig bestätigt. Das Basiskulturmedium enthielt fortgeschrittenes DMEM/F12, ergänzt mit Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES und 20 mM Glutamax. Für Experimente wurden die Zellen nach der Trypsinisierung in einzelne Zellen/kleine Zellklumpen in Matrigel (Corning, Nr. 356231) oder BME (Bio-Techne, Nr. 3533-010-02) in Expansionsmedium (Tabelle 2), ergänzt mit Rock, kultiviert Inhibitor Y-27632 (Gentaur, #607-A3008).

Nach 7 Tagen wurden die Organoide verdünnt und erneut in Platten mit 24 Vertiefungen ausplattiert (4 Tropfen à 11 µl) und das Medium wurde durch Differenzierungsmedium ersetzt (Tabelle 3). Nach 3 Tagen wurde das Differenzierungsmedium aufgefrischt und nach weiteren 20 Stunden wurde 5-FU (Sigma, #F6627) hinzugefügt. Für alle Experimente wurden 100 µM 5-FU verwendet, sofern nicht anders angegeben. Der Zeitpunkt der 5-FU-Behandlungen ist in den Legenden der Abbildungen angegeben.

Behandlungen mit dem ATR-Inhibitor VE-821 (5 µM, Bioconnect, #S8007) und dem ATM-Inhibitor KU-55933 (10 µM, Sigma, #SML1109) wurden 2 Stunden vor der 5-FU-Verabreichung begonnen. Nukleoside (jeweils 25 µM, alle Sigma: Adenosin #A4036, Thymidin #T9250, Guanin #G6264 und Cytidin #C4654) wurden zusammen mit 5-FU hinzugefügt. Behandlungen mit Palbociclib (1 µM, Selleckchem, #S1116)) wurden 24 Stunden vor der 5-FU-Zugabe begonnen. DCA (20 mM, Sigma, Nr. 347795), 2-DG (10 mM, Sigma Nr. D8375) und TEPP-46 (100 µM, Selleckchem, Nr. S7302-Behandlungen) oder Glukosemangel wurden 20 Stunden vor der 5-FU-Behandlung begonnen. Das Glukosemangelmedium wurde mit SILAC Advanced DMEM/F-12 Flex Media (Gibco, Nr. A2494301), ergänzt mit Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES und 20 mM Glutamax, L-Arginin (147,5 mg/L, Sigma, Nr. A6969) hergestellt. l-Lysin (91,25 mg/L, Sigma, L8662) und die angegebene Glucosekonzentration (Merck Millipore, Nr. 1.08337.1000). Für die EdU-Inkorporationsanalyse wurden die Organoide 6 Stunden vor der Sammlung mit 1 µM EdU (Thermo Fisher, #C10636) inkubiert. Einzelheiten zu den Konzentrationen und der Inkubationszeit von Doxycyclin (Sigma, Nr. D9891) und Nutlin-3 (Sanbio, Nr. 10004372) finden Sie in den Legenden der Abbildungen.

Der pInducer-mKate2-NLS-P2A-P53 war ein Geschenk des Snippert-Labors. Aus dem Stammzell-ASCL2-Reporter (STAR)-Plasmid48,50 wurde die 8x STAR-sTomato-NLS-Sequenz in einen lentiviralen Vektor mit einer Puromycin-Resistenzkassette kloniert. Das pcDNA3.1 FLII12Pglu-700uDelta6 (Addgen-Plasmid #17866) war ein Geschenk von Wolf Frommer71. Die eCFP-Sequenz wurde durch eine Codon-optimierte eCFP-Sequenz ersetzt, um eine Rekombination mit der YFP-Sequenz zu verhindern. Die neue Glukosesensorsequenz wurde unter der Kontrolle eines Hef1-Promotors und mit einer Puromycin-Resistenzkassette in einen lentiviralen Vektor kloniert. Diese Konstrukte wurden zusammen mit Verpackungsvektoren der dritten Generation, HEK293T-Zellen und LentiX Concentrator (Clontech) zur Erzeugung und Konzentration lentiviraler Partikel verwendet. Organoide wurden wie in Lit. beschrieben lentiviral transduziert. 97). Kurz gesagt, Organoide wurden trypsinisiert und mit konzentriertem Virus inkubiert (60 Minuten unter Zentrifugation bei 600 U/min bei RT, gefolgt von 4 Stunden bei 37 °C). Als nächstes wurden Organoide in Matrigel plattiert.

Die Organoide wurden einmal mit eiskaltem PBS, ergänzt mit 5 mM NaF (Vwr, Nr. 1.06449.0350) und 1 mM NaVO3 (Sigma, Nr. S6508), gewaschen und darin gesammelt. Organoide wurden zentrifugiert und Pellets in Zellwiederherstellungslösung, ergänzt mit NaF und NaVO3, 15 Minuten lang auf Eis inkubiert. Nach der Zentrifugation wurden die Pellets in Lysepuffer (50 mM Tris pH 7,0, 1 % TX-100, 15 µM MgCl2, 5 µM EDTA, 0,1 mM NaCl, 5 mM NaF, 1 mM NaVO3, 1 µg/ml Leupeptin (Sigma, (Nr. 11034626001) und 1 µg/ml Aprotinin (Sigma, Nr. 10981532001) und der Proteingehalt wurde durch den Biorad-Proteintest (Nr. 500-0006) bestimmt. Die Proben wurden auf den Proteingehalt eingestellt und Laemli-Probenpuffer hinzugefügt. Die Proteine ​​wurden in SDS gemessen -PAGE und auf Immobilon Polyscreen PVDF-Transfermembranen (#IPVH00010, Merck Millipore) oder Amersham Protan Nitrozellulosemembranen (#10600001 GE Healthcare Life Sciences) übertragen. Die Western-Blot-Analyse wurde mit primären Antikörpern durchgeführt, die Folgendes erkennen: Vinculin (1:10.000, Sigma, # V9131), Tubulin (1:5000, Merck Millipore, #CP06 OS), γH2AX (1:10.000, Sigma, #05-636), pChk1(S345) (1:2000, Cell Signaling, #2348, Chk1 (1: 1000, Santa Cruz, #SC-8408), pChk2(T68) (1:1000, Cell Signaling, #2661), Chk2 (1:1000, Cell Signaling, #3440 und Santa Cruz, #SC-9064), pRb( S780) (1:2000, Cell Signaling, #9307), Rb (1:1000, Santa Cruz, #SC-7905), S. 53 (1:1000, Santa Cruz, #SC-126), S. 21 (1:1000, BD Bioscience, Nr. 556430, pPDH(S293) (1:1000, Abcam, Nr. ab92696) und PDH (1:1000, Invitrogen, Nr. 459400). Sekundäre HRP-konjugierte Antikörper gegen Maus- und Kaninchen-IgG wurden von Biorad erworben (1:10.000).

Organoide wurden in eiskaltem DMEM/F12-Medium gesammelt, mit Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES und 1x Glutamax (DMEM/F12 +++-Medium) ergänzt und anschließend mit Trypsin (Sigma) inkubiert. Zur Analyse der Zelllebensfähigkeit wurden die Zellen 5 Minuten lang mit DAPI (Sigma-Aldrich, Nr. D9564) auf Eis gefärbt und sofort mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Lebensfähigkeit wurde durch DAPI-Färbung bestimmt, wobei DAPI−-Zellen als lebend und DAPI+-Zellen als tot galten.

Für die γH2AX-Färbung, die Zellzyklusprofilanalyse und die EdU-Inkorporationsanalyse wurden einzelne Zellen 10 Minuten lang bei RT in (PFA) (#1004965000, Merck Millipore) fixiert und über Nacht auf Eis mit 70 % EtOH permeabilisiert. Für die γH2AX-Färbung und die Analyse des Zellzyklusprofils wurden die Organoide einmal mit 10 ml PBS + 1 % BSA und 0,02 % Tween gewaschen und mit Phospho-Histone H2A.X (Ser 139)-Alexa Fluor 488 (eBioscience, #53-9865-) inkubiert. 82) für 30 Min. bei RT, vor Licht geschützt. Zur Profilierung des Zellzyklus wurden Organoide mit RNAse (100 µg/ml) in PBS für 20 Minuten bei RT und mit DAPI für 2 Stunden auf Eis, vor Licht geschützt, inkubiert. Für den EdU-Nachweis wurden die Zellen mit dem Click-iT Plus EdU Pacific Blue Flow Zytometrie-Assay-Kit (Thermo Fisher, Nr. C10636) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Die Durchflusszytometrie wurde mit einem BD FACS Celesta #660345 durchgeführt.

Die Organoide wurden einmal in eiskaltem PBS gewaschen, in 1 ml eiskalter Zellrückgewinnungslösung (Corning, #354253) und 1 ml eiskaltem PBS in einem 15-ml-Röhrchen gesammelt und 10 Minuten auf Eis inkubiert . Organoide wurden einmal mit eiskaltem PBS gewaschen und mit 4 % PFA (#1004965000, Merck Millipore) 20 Minuten bei RT fixiert und in PBS bei 4 °C gelagert. Zur Färbung wurden Organoide in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt. Organoide wurden mit PBS-Puffer, der 10 % DMSO, 2 % Triton X-100 und 10 g l−1 BSA enthielt, 4 Stunden lang bei 4 °C permeabilisiert. Organoide wurden über Nacht mit Primärantikörpern (γH2AX 1:400, Sigma, Nr. 05-636 und Ki67 1:200, Abcam, Nr. ab15580), 4 Stunden lang mit Alexa-Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern (Invitrogen) und 1 Stunde lang mit DAPI gefärbt bei 4 °C. Die Bildgebung wurde mit einem konfokalen SP8-Mikroskop (Leica Microsystems) durchgeführt. Die Lichtmikroskopie wurde mit dem Bildgebungssystem EVOS M5000 (Invitrogen) durchgeführt.

Die Bildanalyse wurde in ImageJ durchgeführt. Zur Bildanalyse wurden Bilder in 32-Bit-Bilder umgewandelt. Kerne wurden vom Stardist-2D-Makro basierend auf der DAPI-Färbung automatisch erkannt. Innerhalb dieser ROIs wurden Intensitäten von gH2AX, KI67 oder STAR bestimmt. STAR- und STAR+-Zellen wurden als Kerne mit jeweils 20 % niedrigster und höchster STAR-Intensität pro Organoid identifiziert. Für die Ki67-Positivität wurde ein Grenzwert der Intensität 20 verwendet.

Die Bildgebung des Glukose-FRET-Sensors FLII12Pglu-700uDelta6 wurde in 4 unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die Datenanalyse wurde in ImageJ durchgeführt. Bilder von YFP- und CFP-Kanälen wurden in 32-Bit-Bilder umgewandelt, eine automatische Schwellenwertermittlung durchgeführt und das YFP/CFP-Verhältnis mithilfe des Bildrechnertools visualisiert. Die YFP/YFP-Verhältnisse wurden durch Messung des Mittelwerts der Verhältnisse in ganzen Organoiden quantifiziert.

7 Tage nach der Trypsinisierung wurden die Organoide in eine 96-Well-Platte (5 µL BME/Well, 5 Wells/Bedingung) umplattiert. Nach dreitägiger Inkubation im Differenzierungsmedium (t = 0) wurde 5-FU verabreicht und alle zwei Tage wurden Organoide mit dem Bildgebungssystem EVOS M5000 abgebildet. Die Organoidgröße wurde durch manuelle Analyse in ImageJ analysiert.

7 Tage nach der Trypsinisierung wurden die Organoide in eine 96-Well-Platte (5 µL Matrigel/Well, 3 Wells/Zustand) umplattiert. Zur Analyse der Zelllebensfähigkeit wurden Organoide mit dem CyQUANT Direct-Assay (Thermofisher, #C35011) gemäß den Anweisungen des Herstellers zum Nachweis der lebenden Zellen und mit Hoechst (#H1399, Life Technologies) zum Nachweis aller toten und lebenden Zellen 1 Stunde lang bei 37 °C gefärbt °C. Organoide wurden an einem Zellbeobachter Z1 (Zeiss) abgebildet.

In imageJ wurden Bilder in 32-Bit konvertiert und maximale Projektionen von C1- (CyQUANT) und C3-Bildern (Hoechst) erstellt. Organoide in beiden Kanälen wurden vom Stardist-2D-Makro automatisch erkannt, um Regionen von Interesse (ROIs) zu generieren, die jeweils die lebenden Teile (lebende ROIs) und die gesamten Organoide (Gesamt-ROIs) widerspiegeln. In den C1-Bildern wurden die aktiven ROIs maskiert und in Binärbilder umgewandelt. Nun wurden in den binären C1-Bildern die Gesamt-ROIs importiert und der %-Bereich der lebenden ROIs innerhalb dieser Gesamt-ROIs bestimmt und als Lebensfähigkeitswert pro Organoid verwendet.

7 Tage nach der Trypsinisierung wurden die Organoide erneut in eine 24-Well-Platte (4 Tropfen à 11 µL) ausplattiert und auf Differenzierungsmedium kultiviert. Nach 3 Tagen wurde das Medium aufgefrischt und DCA (20 mM) hinzugefügt. Nach 20 Stunden wurde 5-FU (50 µM) verabreicht und die Organoide wurden 48 Stunden lang kultiviert. Dann wurden die Medikamente weggewaschen und die Organoide weitere 7 Tage auf Differenzierungsmedium kultiviert. Nach 7 Tagen wurden die Organoide zu kleinen Klumpen trypsinisiert und erneut in Matrigel in einer 24-Well-Platte und in einer 96-Well-Platte (5 µL Matrigel/Well, 4 Wells/Zustand) ausplattiert. Nach 4 Tagen wurden Organoide in 24-Well-Platten mit EVOS abgebildet. Organoide in 96-Well-Platten wurden mit dem CyQUANT Direct-Assay (Thermofisher, Nr. C35011) gemäß den Anweisungen des Herstellers und von Hoechst 1 Stunde lang bei 37 °C gefärbt. Organoide wurden an einem Zellbeobachter Z1 (Zeiss) abgebildet.

In imageJ wurden Bilder in 32-Bit konvertiert und maximale Projektionen von C1-Bildern (CyQUANT) erstellt. Lebende Organoide (Partikel) wurden vom Stardist-2D-Makro automatisch erkannt.

Der Seahorse Bioscience XFe24-Analysator wurde verwendet, um die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) in Milli-pH (mpH) pro Minute und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in pmol O2 pro Minute zu messen, wie zuvor beschrieben67. Kurz gesagt, Organoide wurden in 3 μl Matrigel pro Vertiefung in XF24-Zellkultur-Mikrotiterplatten (Seahorse Bioscience) ausgesät. Eine Stunde vor den Messungen wurde das Kulturmedium durch Testmedium ersetzt und die Organoide 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Für Experimente mit DCA wurde dem Testmedium auch DCA zugesetzt. Für den mitochondrialen Stresstest wurde das Kulturmedium durch Seahorse und 0,56 μL ml−1 NaOH (1M). Während des Tests wurden 5 μM Oligomycin, 2 μM FCCP und 1 μM Rotenon und Antimycin A (alle Sigma-Aldrich) nach 18, 45 bzw. 63 Minuten in jede Vertiefung injiziert. Für den Glykolyse-Stresstest wurde das Kulturmedium durch Seahorse XF-Basismedium ersetzt, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und 0,52 μL mL-1 NaOH (1 M). Während des Tests wurden 10 mM Glucose, 5 μM Oligomycin und 100 mM 2-Desoxyglucose (Sigma-Aldrich) nach 18, 36 bzw. 65 Minuten in jede Vertiefung injiziert. Nach den Injektionen wurden 2-minütige Messungen im Triplo-Verfahren durchgeführt, gefolgt von einer 4-minütigen Mischzeit. Den ersten Messungen nach Oligomycin-Injektionen gingen 5 Minuten Mischzeit, gefolgt von 8 Minuten Wartezeit für den mitochondrialen Stresstest und 5 Minuten Mischzeit gefolgt von 10 Minuten Wartezeit für den Glykolyse-Stresstest voraus. Die OCR- und ECAR-Werte pro Gruppe wurden auf die Gesamtmenge an DNA normalisiert, die in allen Vertiefungen der entsprechenden Gruppe vorhanden war.

Organische Lösungsmittel hatten ULC-MS-Qualität und wurden von Biosolve (Valkenswaard, Niederlande) bezogen. Chemikalien und Standards waren analysenrein und wurden von Sigma-Aldrich (Zwijndrecht, Niederlande) bezogen. Wasser wurde am Tag der Verwendung aus einem Milli-Q-Gerät (Merck Millipore, Amsterdam, Niederlande) entnommen.

Für die Metabolomik wurden pro Bedingung 3 Vertiefungen mit 200 µL organoidhaltigem Matrigel verwendet. Während der Behandlung wurden das Medium und die Medikamente 7 Stunden vor der Entnahme aufgefrischt. Zum Zeitpunkt der Entnahme wurden aus jeder Vertiefung 500 µl Medium pro Vertiefung gesammelt, mit Medium aus den anderen Vertiefungen unter den gleichen Bedingungen gepoolt und in flüssigem Stickstoff in 2-ml-Eppendorf-Röhrchen eingefroren. Organoide aus demselben Zustand wurden während der Sammlung gepoolt. Organoide wurden einmal mit eiskaltem PBS gewaschen und anschließend in eiskaltem PBS in einem 15-ml-Falcon-Röhrchen gesammelt. Nach einem weiteren Waschen mit eiskaltem PBS wurden die Organoide in 2-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt, zentrifugiert, in 80 % eiskaltem Methanol resuspendiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Die Proben wurden in einem Labconco Centrivap (VWR, Amsterdam, Niederlande) zur Trockne eingedampft. Dem Rückstand wurden 350 µL Wasser, 10 µL 1 mM interner Ribitol-Standard in Wasser, 375 µL Methanol und 750 µL Chloroform zugesetzt. Nach dem Pulsvortex-Mischen wurden die Proben 2 Stunden lang in einem VWR-Thermostatschüttler (900 U/min, 37 °C) inkubiert. Nach Zentrifugation bei Raumtemperatur (10 Min., 15.000 × g) wurde die obere wässrige Phase quantitativ in ein sauberes 1,5-µL-Eppendorf-Röhrchen überführt und über Nacht im Labconco Centrivap zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 µL Wasser gelöst, in ein Injektionsfläschchen überführt und während der LC-MS-Analyse bei 6 °C gehalten.

Die LC-MS-Analyse wurde mit einer 2,1 × 100 mm großen Atlantis Premier BEH-C18 AX-Säule (2,1 × 100, 2,5 µm) durchgeführt, die mit einer VanGuard-Säule verbunden war, beide gekauft von Waters (Etten-Leur, Niederlande). Der Säulenaufbau wurde in ein Ultimate 3000 LC-System (Thermo Scientific, Breda, Niederlande) eingebaut. Der Säulenauslass war mit einem Thermo Scientific Q-Exactive FT-Massenspektrometer verbunden, das mit einer HESI-Ionenquelle ausgestattet war. Das UPLC-System wurde mit einer Flussrate von 250 μL min−1 betrieben und die Säule wurde auf 30 °C gehalten. Die mobilen Phasen bestanden aus 10 mM Ammoniumacetat und 0,04 (v/v) Ammoniumhydroxid in Wasser, pH 9 (A) bzw. Acetonitril (B). Nach der Probeninjektion von 5 µL wurde das System 1 Minute lang bei 0 % B gehalten, gefolgt von einem 4-minütigen linearen Gradienten von 0–30 % B. Danach stieg der Gradient innerhalb von 3 Minuten linear auf 95 % B an und wurde 2 Minuten lang bei 95 % gehalten Mindest. Die Säule wurde vor einer nächsten Injektion 6 Minuten lang bei 0 % B regeneriert. Alle Proben wurden dreimal injiziert (3 technische Replikate). Massenspektrometriedaten wurden über einen Scanbereich von m/z 72 bis 900 erfasst. Das System wurde bei –2,5 kV (Negativmodus) und einer Massenauflösung von 120.000 betrieben. Weitere Quelleneinstellungen waren: Transferrohr- und Verdampfertemperatur 350 °C bzw. 300 °C und Hüllgas- und Hilfsgasdruck 35 bzw. 10 °C. Für eine hohe Massengenauigkeit wurde vor jedem Experiment eine Massenkalibrierung durchgeführt. Rohdatendateien wurden mit der XCalibur Quan-Software verarbeitet und analysiert.

Die statistische Analyse für Bildanalyse-, Durchflusszytometrie- und Metabolomics-Ergebnisse wurde mit Graphpad Prism 8 durchgeführt. Zuerst wurde die Gaußsche Verteilung der Daten mit einem Shapiro-Wilk-Test getestet, um anschließend parametrische oder nichtparametrische Statistiken anzuwenden. Einzelheiten zur Statistik sind in den Abbildungslegenden beschrieben.

Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die in den Legenden der Abbildungen dargestellten Probengrößen auf die Anzahl unabhängiger Experimente. Wenn sich die Stichprobengröße auf technische Replikate bezieht, wird dies in den Legenden der Abbildungen erläutert. Für die Metabolomik stammten technische Replikate aus wiederholten Messungen. In allen anderen Fällen stammten technische Replikate von unterschiedlichen Proben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle im Rahmen dieser Studie generierten Daten sind in diesem Artikel enthalten. Die Quelldaten werden als Ergänzungsdaten 1 (Hauptfiguren) und 2 (Ergänzungsfiguren) bereitgestellt. Unbeschnittene und unbearbeitete Blot-Bilder sind in der ergänzenden Abbildung 7 enthalten.

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Referenzen herunterladen

Wir danken HJG Snippert (UMC Utrecht) für die Bereitstellung des Stammzellaktivitäts-Reporterplasmids; SEM van der Horst und HJG Snippert (UMC Utrecht) für die gemeinsame Nutzung des P53-Überexpressionskonstrukts; W. Frommer (Heinrich-Heine-Universität) für die Weitergabe des Glucose-FRET-Sensorplasmids; I. Verlaan (UMC Utrecht) zur Herstellung von R-Spondin- und Noggin-konditioniertem Medium; und A. Janssen und J. Lehman für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Niederländischen Krebsgesellschaft finanziell unterstützt (KWF 2016-I 10471, KWF 2017-II 11315).

Molekulare Krebsforschung, Zentrum für Molekulare Medizin, Universitätsklinikum Utrecht, 3584 CG, Utrecht, Niederlande

Marlies C. Ludikhuize, Sira Gevers, Nguyen TB Nguyen, Maaike Meerlo, S. Khadijeh Shafiei Roudbari, M. Can Gulersonmez, Edwin CA Stigter, Boudewijn MT Burgering und Maria J. Rodríguez Colman

Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 3584 CS, Utrecht, Niederlande

Jarno Drost & Hans Clevers

Oncode Institute, Utrecht, Niederlande

Jarno Drost & Hans Clevers

Hubrecht-Institut, Königliche Niederländische Akademie der Künste und Wissenschaften, 3584 CT, Utrecht, Niederlande

Hans Clevers & Boudewijn MT Burgering

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Konzeptualisierung, MJRC, MCL und BMTB; Methodik und Untersuchung, MJRC, MCL, MM, SG, NTBN und SKSR; Metabolomik: MCG und ECAS; Entwicklung des Tumorprogressions-Organoidmodells: JD und HC; Manuskriptschreiben, MJRC und MCL; Überprüfung und Bearbeitung, MJRC und BMTB; Finanzierungseinwerbung, MJRC und BMTB

Korrespondenz mit Maria J. Rodríguez Colman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Ozgur Sahin und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Maralice Conacci Sorrell und Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ludikhuize, MC, Gevers, S., Nguyen, NTB et al. Die Neuverkabelung des Glukosestoffwechsels verbessert die 5-FU-Wirksamkeit bei p53-defizienten/KRASG12D-glykolytischen kolorektalen Tumoren. Commun Biol 5, 1159 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04055-8

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Eingegangen: 26. November 2021

Angenommen: 30. September 2022

Veröffentlicht: 31. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04055-8

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