Hochauflösende Funktionsanalyse und Gemeinschaftsstruktur von Photogranulaten

The ISME Journal Band 17, Seiten 870–879 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Photogranulate sind kugelförmige Aggregate aus komplexen phototrophen Ökosystemen mit Potenzial für eine „belüftungsfreie“ Abwasserbehandlung. Photogranulate aus einem Sequenzierungs-Batch-Reaktor wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie, 16S/18S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung, Mikrosensoren sowie Inkubationen mit stabilen und Radioisotopen untersucht, um die Zusammensetzung, die Nährstoffverteilung sowie die Licht-, Kohlenstoff- und Stickstoffhaushalte der Granulate zu bestimmen. Die Photogranula waren biologisch und chemisch geschichtet, wobei filamentöse Cyanobakterien in diskreten Schichten angeordnet waren und ein Gerüst bildeten, an dem andere Organismen befestigt waren. Auch Sauerstoff-, Nitrat- und Lichtgradienten waren nachweisbar. Sowohl die Photosyntheseaktivität als auch die Nitrifikation waren überwiegend auf die äußeren 500 µm beschränkt. Während die Photosynthese jedoch relativ unempfindlich gegenüber den getesteten Sauerstoff- und Nährstoffkonzentrationen (Ammonium, Phosphat, Acetat) war, war die Nitrifikation sehr empfindlich. Der Sauerstoffkreislauf erfolgte intern, wobei der durch Photosynthese erzeugte Sauerstoff durch aerobe Atmung und Nitrifikation schnell verbraucht wurde. Sauerstoffproduktion und -verbrauch waren gut ausbalanciert. In ähnlicher Weise wurde Stickstoff durch paarweise Nitrifikation und Denitrifikation zirkuliert, und Kohlenstoff wurde durch Photosynthese und Atmung ausgetauscht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es sich bei Photogranulaten um vollständige, komplexe Ökosysteme mit mehreren miteinander verbundenen Nährstoffkreisläufen handelt und dass sie technische Entscheidungen bei der photogranularen Abwasserbehandlung unterstützen werden.

Abwasserbehandlungsreaktoren selektieren kontinuierlich nach funktionellen Merkmalen in ihren mikrobiellen Gemeinschaften. Die Manipulation der Betriebsbedingungen ermöglicht die Auswahl gewünschter Merkmale, einschließlich Umwandlungsprozessen zur Wasserreinigung und Selbstaggregation mikrobieller Biomasse. Die Selbstaggregation (d. h. die Bildung von Biogranulaten, kugelförmigen Aggregaten von Mikroorganismen) ermöglicht die Schichtung (oxische und anoxische Zonen) und erleichtert die Biomasseernte, da dichte Aggregate schnell absinken, sobald das Mischen im Reaktor gestoppt wird. Im Allgemeinen werden Biogranulate in Reaktoren gebildet, in denen die Verweilzeit der Flüssigkeit kürzer ist als die Verdopplungszeit der Mikroorganismen. Dadurch werden suspendierte Zellen ausgewaschen und ein selektiver Druck zur Biomasseretention erzeugt [1, 2]. Obwohl die aggregierte Biomasse in Biogranulaten Stoffübergangswiderständen unterliegt, die die Aktivität pro Zelle verringern, sorgt eine effiziente Biomasseretention und die daraus resultierende erhöhte Biomasse für stark erhöhte volumetrische Umwandlungsraten in Biogranulareaktoren.

Phototrophe Biogranulate, sogenannte Photogranules, wurden erstmals in Kulturen photosynthetischer Matten aus der Nordsee beobachtet [3]. Die Körnchen bestanden aus filamentösen Cyanobakterien, Kieselalgen und heterotrophen Bakterien. Eine sphärische Geometrie ist in phototrophen Gemeinschaften selten, es wurden jedoch einige Beispiele für Photogranula in der Natur beschrieben. Beispielsweise finden sich in Gletschern Photogranulate, die aus Cyanobakterien und heterotrophen Bakterien bestehen und Kryokonite genannt werden [4, 5]. Grüne und rosa mikrobielle „Beeren“ kommen in Salzwiesen vor, die durch eine Symbiose von Cyanobakterien und Kieselalgen sowie von Gemeinschaften schwefeloxidierender violetter Schwefelbakterien bzw. schwefelreduzierender Bakterien entstehen [6, 7].

In phototrophen Biofilmen in der Natur, wie auch in Photogranulaten, werden aufgrund der Diffusionsbegrenzung Konzentrationsgradienten verschiedener gelöster chemischer Spezies (z. B. Sauerstoff, Substrate) gebildet. Ebenso entstehen Lichtintensitätsgradienten durch Lichtabsorption und -streuung [8]. Diese sich überschneidenden Gradienten schaffen eine abwechslungsreiche Umgebung, die das gleichzeitige Wachstum verschiedener Mikroorganismen unterstützen kann, die verschiedene Nischen füllen, wie z. B. Photoautotrophe, Chemoautotrophe und Heterotrophe, die einen aeroben und anaeroben Stoffwechsel aufweisen [9]. Zwischen diesen mikrobiellen Gruppen finden komplexe Wechselwirkungen statt, die das Funktionieren des Konsortiums stabilisieren können [10]. Beispielsweise können Heterotrophe auf extrazellulären organischen Verbindungen wachsen, die von Phototrophen ausgeschieden werden. Letzteres wiederum kann das beim heterotrophen Wachstum entstehende anorganische CO2 fixieren. Aerobe Chemoautotrophe, wie z. B. Nitrifizierer, können von durch die Photosynthese gesteigerten Sauerstoffgehalten profitieren und gleichzeitig mit Phototrophen um anorganischen Kohlenstoff und Stickstoff konkurrieren. Im Gegensatz zu Biofilmen sind Photogranulate frei lebend, sodass ihre Biomasse nicht auf die Oberfläche ihres Behälters beschränkt ist. Darüber hinaus ist das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen einer Kugel so, dass bei kleinen Kugeln ein höherer Biomasse-Wasser-Austausch möglich ist als in einer Ebene mit demselben Volumen. Diese Beziehung gilt, solange der Radius der Kugel weniger als ein Drittel der Dicke der Ebene beträgt.

Kürzlich wurden Photogranulate mit Selektionsdruck kultiviert, um Stickstoff, Phosphor und Kohlenstoff aus Abwasser zu entfernen und zurückzugewinnen [11,12,13,14,15,16,17]. Dabei kam es nach der Sedimentation der Biomasse zu einem regelmäßigen Austausch des Mediums und damit zu einem Selektionsdruck in Richtung der Bildung schnell sedimentierender Granulatkörner. Die Körnchen zeigten in der Tat hervorragende Absetzeigenschaften und ihre in-situ-photosynthetische Sauerstoffproduktion trieb sauerstoffintensive mikrobielle Prozesse wie Nitrifikation und Atmung an. Dadurch wurden die O2- und CO2-Kreisläufe innerhalb des Aufbereitungsprozesses verknüpft und Fortschritte in Richtung einer „belüftungsfreien“ Abwasserbehandlung erzielt. Erste Studien untersuchten die physikalische Struktur und die Stoffwechselfunktionen einzelner Photogranulate aus Abwasser, beschränkten sich jedoch auf phototrophe Organismen und Sauerstoffprofile [18,19,20]. Ein Modellierungsansatz prognostizierte die Verteilung von Mikroorganismen und extrazellulären Polymersubstanzen (EPS) innerhalb von Photogranulaten sowie den Massenumsatz chemischer Verbindungen und Reaktorfunktionen basierend auf unterschiedlichen Nährstoffeinträgen, wurde jedoch noch nicht in realen Photogranulaten getestet [21, 22].

Photogranulate unterliegen während des Reaktorbetriebs sowohl unterschiedlichen äußeren Umgebungsbedingungen (z. B. Lichtintensität, Nährstoffkonzentrationen) als auch internen Bedingungen, da Nährstoffgradienten als Reaktion auf mikrobielle Aktivität und äußere Schwankungen erzeugt und beseitigt werden. Daher erfordert ein vollständiges Verständnis der mikrobiellen Ökologie in Photogranulaten eine detaillierte Untersuchung unter verschiedenen und variierenden Bedingungen in vivo. Hier untersuchten wir die physikalische und biologische Schichtung und Funktion dieser Photogranulate mit mikroskopischer Bildgebung, Metataxonomie, Mikrosensoren und Inkubationen mit Radio- und stabilen Isotopenmarkierungen. Unsere Ergebnisse geben Einblick in die räumliche und zeitliche Verteilung der funktionellen Aktivität (Photosynthese, Nitrifikation und Denitrifikation) innerhalb von Photogranula und deren Abhängigkeit von externen Faktoren (Licht, Nährstoffe). Darüber hinaus können die Ergebnisse zur Unterstützung technischer Entscheidungen in der photogranularen Abwasserbehandlung genutzt werden.

Photogranulate wurden aus Bioreaktoren wie zuvor beschrieben erhalten [12] (Abb. S1). Die Bioreaktoren waren Blasensäulen mit einer Höhe von 38 cm, einem Durchmesser von 10 cm und einem Bodenkegel von 10 cm Höhe. Das Arbeitsvolumen betrug 1,6 l und stand 28 cm vom Boden des Kegels entfernt. Das Mischen wurde durch Begasung mit mit 5 % v/v CO2 angereicherter Luft mit einer Geschwindigkeit von 500 ml/min erreicht. Die Temperatur wurde mithilfe eines externen Wasserbads bei 35 °C und der pH-Wert durch automatische Zugabe von 1 M HCl oder 1 M NaOH bei 6,8 ± 0,1 gehalten. Bioreaktoren wurden im Sequenzierungs-Batch-Modus mit einer Absetzzeit von 5 Minuten, einer hydraulischen Verweilzeit (HRT) von 0,67 Tagen und einem Betriebszyklus von 12 Stunden betrieben. Dem Sequenzierungs-Batch-Zyklus wurden Tag-Nacht-Zyklen von 12 Stunden überlagert, so dass jeder Batch-Zyklus 6 Stunden Licht und 6 Stunden Dunkelheit ausgesetzt war. LED-Lampen mit warmweißem Licht (4000 K) (Avago ASMT-MY22-NMP00, Broadcom Inc., USA), die an einer Seite des Bioreaktors positioniert waren, lieferten eine einfallende Lichtintensität von 500 µmol m−2 s−1 an der Oberfläche des Bioreaktors während der Lichtphase. Eine Schlammretentionszeit (SRT) von 7 Tagen wurde durch die automatische Entfernung von 114 ml der gemischten Flüssigkeit am Ende jedes Chargenzyklus über eine Schlauchpumpe erreicht. Der Zulauf enthielt 100 mgN L−1 (7,1 mmolN L−1) als Ammonium, 10 mgP L−1 (0,3 mmolP L−1) und 200 mgCOD L−1 (3,2 mmol L−1 Natriumacetat). Die Bioreaktoren wurden 299 Tage lang betrieben. Photogranulate wurden während stabiler Betriebsperioden am Tag 105, 186, 214, 270 und 299 aus der Mischphase des Bioreaktors entnommen und entweder direkt analysiert oder für spätere mikroskopische Untersuchungen in Paraformaldehyd (PFA) in 5 % phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert Analyse. Die Photogranulate waren zwischen 0,4 und 5 mm breit und hatten einen durchschnittlichen Durchmesser von 2,6 mm. Für die Analyse wurden Photogranulate mit einer Breite von 2 bis 4 mm verwendet.

Ein Stereomikroskop (Leica M205C, Deutschland) wurde verwendet, um ganze und geschnittene Photogranulate unter weißem Licht sichtbar zu machen. Die Bilder wurden mit der Leica Application Suite (LAS Version 4.13, Deutschland) aufgenommen. Die dreidimensionale Struktur des Granulats wurde mittels Mehrkanal-CLSM (Leica TCS SP5X, Deutschland) untersucht. Das System mit einem aufrechten Mikroskop und einer Superkontinuumslichtquelle wurde durch die Software LAS-AF 2.4.1 gesteuert. Bilddatenstapel wurden mit Wasserimmersionsobjektiven mit 25× NA 0,95 und 63× NA 1,2 aufgenommen. Die Proben wurden mit Abstandshaltern in einer Abdeckkammer montiert. Zu diesem Zweck wurden die Photogranulate halbiert und in der Kammer eingefärbt, die dann mit Wasser gefüllt und mit einem Deckglas verschlossen wurde. Um ein geeignetes Lektin zu identifizieren, wurde ein Screening mit allen kommerziell erhältlichen Lektinen durchgeführt. Glykokonjugate wurden nach Staudt et al. durch Fluoreszenz-Lektin-Bindungsanalyse (FLBA) nachgewiesen. und Zippel und Neu [22, 23]. Nach dem Testen mehrerer Lektine wurde das mit Alexa-568 markierte BAN-Lektin für die Bildgebung ausgewählt. BAN ist ein aus der Banane (Musa paradisiaca) gewonnenes Lektin, das eine Einzelkohlenhydratbindungsspezifität für D-Mannose und D-Glucose aufweist [24]. Als Gegenfärbung zur Visualisierung von Nukleinsäuren wurde das Fluorochrom Syto9 verwendet. Cyanobakterien und eukaryotische Algen wurden anhand ihrer Pigmente identifiziert [25, 26]. Die Einstellungen für die sequentielle Aufzeichnung von Bilddatenstapeln waren wie folgt: Anregung: 480, 635 nm und 565 nm, Emission: 500–550 nm (Syto9), 585–650 nm (BAN-A568, Phycobiline), 650–720 nm (Chl A). Die Bilder wurden mit der Bildbearbeitungssoftware Fiji [27] verarbeitet und einzelne Bilddatenstapel mit Photoshop (Version CS6) zusammengefügt.

Zur Beurteilung der mikrobiellen Gemeinschaft wurden DNA-Proben entnommen. Konkret wurden 15 ml der geernteten Photogranulate mit einer Glas-/Teflon-Gewebemühle homogenisiert, in fünf 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert, 10 Minuten lang bei 14,87 × 103 rcf zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellpellets wurden sofort bis zur weiteren Verarbeitung bei –80 °C eingefroren. Die DNA von 200 mg feuchtem Zellpellet wurde dreifach mit dem DNeasy PowerSoil Pro Isolation Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die Menge und Qualität der DNA wurden spektrophotometrisch mit einem NanoDrop One (ThermoFisher Scientific, USA) bestimmt. Die DNA-Proben wurden zur Sequenzierung an Génome Québec (McGill University, Montreal, CA) übermittelt. Die variable Region des 16S-rRNA-Gens V3/V4 wurde unter Verwendung des Primerpaars 341F (CCTACGGGNGGCWGCAG) und 805R (GACTACHVGGGTATCTAATCC) amplifiziert (28). Die variable Region des 18S-rRNA-Gens V4 wurde mit dem Primerpaar 616*F (TTAAARVGYTCGTAGTYG) und 1132R (CCGTCAATTHCTTYAART) amplifiziert [29]. Beide Primersätze wurden modifiziert, um Illumina-Adapterüberhang-Nukleotidsequenzen zu den genspezifischen Sequenzen hinzuzufügen. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines MiSeq-Systems (Illumina, USA) mit 300-bp-Reads (v3-Chemie) durchgeführt. Primer wurden mit Cutadapt (Version 1.18) aus den Rohsequenzen entfernt [30]. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit dem DADA2-Programm weiterverarbeitet [31]. Der taxonomische Abgleich der Sequenzen erfolgte mit der SILVA-Datenbank (Release 138) mithilfe von SINA (https://www.arb-silva.de). Der 16S- und 18S-Datensatz wurde mithilfe der CSS-Funktion (Cumulative Sums Scaling) des R-Pakets metagenomSeq Version 1.24.1 normalisiert [32]. Die Analyse der Mikrobiomdaten erfolgte mit dem R-Paket phyloseq (Version 1.26.1) [33]. Die Rohdaten der 16S- und 18S-rRNA-Gensequenzen sind in der EBI-Datenbank unter der Projektnummer PRJEB54633 verfügbar.

Photogranulate wurden mit Glasnadeln an einem Nylonnetz befestigt, das über einer kleinen Petrischale angebracht war (Abb. S2). Die Petrischale wurde in Leitungswasser getaucht (Tabelle S1) und wie angegeben mit Acetat, Mediumvorräten und Nitrat versetzt. Die Sauerstoffkonzentration wurde mit einem Sauerstoffmikrosensor vom Clark-Typ [34] bestimmt, der an einem motorisierten Mikromanipulator angebracht und in sauerstoffgesättigtem Wasser und basischem Natriumascorbat (sauerstofffreie Basislinie) zweipunktkalibriert war. Die Nitratkonzentrationen wurden mit einem selbst hergestellten Nitrat-LIX-Membransensor (Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, Bremen, Deutschland) bestimmt, der in einer Nitratverdünnungsreihe kalibriert wurde [35]. Lichtprofile wurden mit einem skalaren Bestrahlungsstärke-Lichtmikrosensor mit einer 80 µm großen Kugelspitze (Zensor, Dänemark) [36] bestimmt, der an ein USB4000-Glasfaserspektrophotometer (Ocean Optics, USA) angeschlossen war [37]. Um Profile zu erfassen, durchbohrten Mikrosensoren das Granulat und wurden dabei schrittweise von einem motorisierten Mikromanipulator angetrieben.

Unter Verwendung der aus den Mikrosensormessungen generierten Sauerstoff- und Nitratprofile wurden die Nettoverbrauchs-/Produktionsraten der Reaktanten berechnet, indem das Granulat in „Schalen“ aufgeteilt wurde, wobei jede Schale die Breite des Abstands zwischen den Messungen hatte und eine sphärische Geometrie angenommen wurde. Der Fluss zwischen einem Punkt im äußeren Teil der Schale und einem Punkt im inneren Teil der Schale wurde berechnet und dann mit der Oberfläche der Schale multipliziert.

mit P als der Umwandlungsrate pro Aggregatschale (in dieser Arbeit ausgedrückt in nmol/h), mit D als Diffusionskoeffizient, dCr/dxr dem Konzentrationsgradienten des Reaktanten am Ort r und r dem radialen Abstand von der Schalenoberfläche zu das Zentrum des Aggregats. Die Gesamtumrechnungsraten wurden durch Addition der Aktivitäten in allen Shells ermittelt, da die Raten die Gesamtaktivitäten und nicht die auf das Volumen normierten Aktivitäten darstellen. Um die volumetrische Rate zu ermitteln, wurde die Produktionsrate jeder Hülle durch das Volumen dieser Hülle dividiert. Der für Sauerstoff verwendete Diffusionskoeffizient betrug 2000 µm2 s−1 (Bionumbers ID 104440) [38, 39] und der für Nitrat verwendete Koeffizient betrug 1700 µm2 s−1 (Bionumbers ID 104439) [38, 39].

Die einzelnen Photosyntheseraten wurden bestimmt, indem der Mikrosensor in einer festgelegten Tiefe platziert und das Licht dann 5–10 s lang abgedeckt wurde. Die Geschwindigkeit der Abnahme der Sauerstoffkonzentration entspricht der Photosyntheserate in dieser Tiefe.

Photogranulate wurden ohne Headspace in 5,9-ml-Glasfläschchen bei pH 6,5 in Leitungswasser, angereichert mit entweder 3 mM oder 10 mM Natriumbicarbonat, und angereichert mit 8 mM Ammonium, 3 mM Phosphat und/oder 3 mM Acetat, wie angegeben, inkubiert. Es gab 3–4 Photogranulate pro Fläschchen, mit einem Fläschchen pro Bedingung, mit Ausnahme der Inkubation mit Ammonium und Phosphat, wo es 2 Fläschchen gab. Zusätzlich wurden Photogranulate mit ~60 kBq 14C-Bicarbonat versehen. Die Fläschchen wurden ständig gedreht und 6 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln (Nitrifikationsexperiment) oder im Licht (Photosynthese, ~250 µmol m−2 s−1) inkubiert. Die Inkubationen wurden gleichzeitig durchgeführt. Die Inkubationen wurden gestoppt, indem 600 µL Überstand entfernt und durch eine 20 %ige Paraformaldehydlösung (PFA) ersetzt wurden, wodurch eine Endkonzentration von 2 % PFA erreicht wurde. Zur Kontrolle verwendete Photogranulate (Blindproben) wurden zunächst in PFA abgetötet und dann 6 Stunden lang dem Tracer ausgesetzt.

Die Photogranulate wurden zweimal in 10 mM Carbonatpuffer gewaschen, um nicht umgesetzten Carbonat-Tracer zu entfernen, und durch Eintauchen in eine Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT, Leica) über Nacht eingebettet, dann in 1-ml-Plastikbechern bei –20 °C eingefroren und in 20 µm dicke Scheiben geschnitten in einem Kryomikrotom. Die Schnitte wurden auf Polylysin-Objektträgern aufgefangen und die Radioaktivitätsverteilung in einem Radio-Imager (BioSpaceLab, Paris) abgebildet, bis 106 Zählungen erhalten wurden. Die Leerwerte wurden 12 Stunden lang gezählt, da 106 Zählungen nicht in angemessener Zeit erzielt werden konnten. Die erzeugten Bilder wurden dann mit M3Vision (BioSpaceLab, Paris) analysiert. Die CO2-Aufnahme des gesamten Granulats wurde ermittelt, anschließend pro mm2 normiert und dann durch die Dicke des Aggregatabschnitts dividiert, um volumetrische Raten zu erhalten (siehe Abb. S6).

Photogranulate wurden in gasdichten 6-ml-Glasfläschchen in Leitungswasser, angereichert mit 3 mM Natriumbicarbonat und entweder 1 mM 15 N Ammonium oder 1 mM 15 N Nitrat, inkubiert und wie angegeben ohne Luftraum bei Raumtemperatur im Dunkeln oder Licht inkubiert. In jedes Fläschchen wurden zwei Photogranulate gegeben, ein kleines und ein großes. Pro Bedingung wurden vier separate Fläschchen vorbereitet, und die Photogranulate in einem Fläschchen pro Gruppe wurden zu vier verschiedenen Zeitpunkten (~0, 2, 4,5 und 5,5 Stunden Inkubation) abgetötet. Photogranules wurden mit einer 1:1 w/v ZnCl-Lösung abgetötet. Als Leerwert wurde der Zeitpunkt 0 verwendet.

Nach dem Abtöten des Photogranulats wurde in jedem Fläschchen ein 2-ml-Helium-Kopfraum erzeugt. Die Fläschchen wurden kräftig geschüttelt und man ließ sie 5 Tage lang ins Gleichgewicht kommen. Anschließend wurden 150 µL Headspace in ein IR-MS injiziert und auf 15N-N2 analysiert. Die Injektionen wurden anhand einer Reihe von Umgebungsluftinjektionen kalibriert, was die Berechnung des überschüssigen 15N-Stickstoffgehalts ermöglichte. Der Gesamtüberschuss an 15N wurde berechnet als (Überschuss an 29N2 + (2 × Überschuss an 30N2)). Die Denitrifikationsraten wurden berechnet, indem eine lineare Gleichung an die überschüssige 15N-Produktion angepasst wurde [40].

NOx, die Summe aus Nitrat und Nitrit, wurde mit saurem Vanadiumchlorid in NO umgewandelt und mit einem CLD 60 Chemilumineszenz-NO/NOx-Analysator gemessen [41]. Der NOx-Gehalt wurde anhand einer Verdünnungsreihe von Nitrat kalibriert. Die Nitrifikationsrate wurde dann bestimmt, indem eine lineare Gleichung an die Summe des überschüssigen 15N zu jedem Zeitpunkt und die NOx-Konzentration angepasst wurde.

Die Photogranulate waren physikalisch robust und zeigten eine deutliche Schichtung (Abb. 1). Filamentöse Cyanobakterien (Phycobilin und Chl A-Autofluoreszenz) mit Gleitbewegung bildeten ein komplexes Netzwerk, das als Gerüst für andere Mikroorganismen fungierte. Eine dichte Hülle aus sowohl phototrophen als auch nicht phototrophen Organismen (gefärbt durch SYTO9) bildete die äußeren 300–500 µm des Granulats. Unterhalb dieser Hülle befand sich eine Zone radial ausgerichteter filamentöser Cyanobakterien, gefolgt von einem dichten und durcheinandergebrachten Zentrum. Kokkoide eukaryotische Algen (Chl-a-Autofluoreszenz) waren in Mikrokolonien im gesamten Photogranulat vorhanden (Abb. S4). Glykokonjugate (sichtbar durch Lektinfärbung) umgaben die filamentösen Cyanobakterien im gesamten Photogranulat (Abb. S4D). Glykokonjugate zeigen die Ausscheidung extrazellulärer Polymersubstanzen (EPS) durch phototrophe und nicht-phototrophe Organismen an und können zur physikalischen Struktur des Photogranulats beitragen und als „Klebstoff“ dienen. Das in dieser Studie verwendete BAN-Lectin visualisiert Glykokonjugate mit D-Glucose- und D-Mannose-Monosaccharid-Bausteinen.

Ein CLSM-Bild eines Photogranulat-Querschnitts, das die Nukleinsäurefärbung (grün), Photopigmente filamentöser Cyanobakterien als Überlagerung von Phycobilinen (rot) und Chlorophyll A (blau), was zu Lila führt, sowie das Chlorophyll A eukaryontischer Mikroalgen (blau) zeigt das Lektinsignal von Glykokonjugaten (rot). Die CLSM-Bilder bestehen aus 14 zusammengefügten Einzelbildern. Aufgrund der Einschränkungen der CLSM-Technik konnte nur die Hälfte des Photogranulats erfasst werden und zu Darstellungszwecken wurde das Bild über der weißen vertikalen Linie gespiegelt. B Makrofotografie eines Photogranulats unter weißem Licht. Das linke Bild zeigt das gesamte Photogranulat und das rechte Bild den Querschnitt desselben Photogranulats. C Nahaufnahme des CLSM-Querschnitts von der Mitte bis zur Oberfläche des Photogranulats. Der Querschnitt kann in drei verschiedene Zonen unterteilt werden: (1) das Zentrum, (2) radial ausgerichtete Filamente und (3) die Hülle.

Die mikrobielle Gemeinschaft bestand sowohl aus phototrophen Organismen, einschließlich beweglicher filamentöser Cyanobakterien und eukaryontischer Algen, als auch aus nicht phototrophen Organismen (Abb. 2A). Die 16S-rRNA-Gensequenzen wurden von Amplikonsequenzierungsvarianten (ASV) dominiert, die phototrophen Organismen aus dem Stamm Cyanobacteria (37 %) und nicht phototrophen Organismen aus der Klasse Proteabacteria (28 %) zugeschrieben wurden. Die beiden am häufigsten vorkommenden ASV waren die Cyanobakterien Leptolyngbya boryana mit einer relativen Häufigkeit von 15 % und Alkalinema pantanalense mit einer relativen Häufigkeit von 13 %. Die Nitrifikanten Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. und Nitrospira sp. machten etwa 2 % der prokaryotischen Gemeinschaft aus, während die aeroben Chemoheterotrophen und Denitrifizierer Thauera sp. und Zoogloea sp. machte 15 % der relativen Häufigkeit aus. Streng anaerobe Prokaryoten aus der Familie Anaerolineaceae und Caldilineaceae machten zusammen 5 % der ASVs aus, was darauf hindeutet, dass ein Teil des Photogranulats anoxisch war. Dies wird tatsächlich durch Mikrosensorik im folgenden Abschnitt bestätigt. Die 18S-rRNA-Gensequenzen wurden von ASVs dominiert, die eukaryontischen Mikroalgen (58 %), Pilzen (18 %) und Protisten (2 %) zugeschrieben wurden (Abb. 2B). Bei den vorhandenen eukaryotischen Algen handelte es sich um Chlorella sp. (39 %), Chlorococcum sp. (13 %), Botryoshaerella sp. (1%) und Tetradesmus sp. (1 %). Der vorhandene Pilz war Trichosporon sp. (18 %).

Die relative Häufigkeit wird auf der Phylum-Ebene angegeben. Alle ASVs mit einer Häufigkeit von weniger als 1 % werden gruppiert und in den beiden Balkendiagrammen als „< 1 % Häufigkeit“ angezeigt. „NA“ sind ASVs, die nicht auf Stammebene zugeordnet sind. Ein 16S-Datensatz und B 18S-Datensatz.

Die Photogranulate absorbierten effektiv Licht im gesamten sichtbaren Lichtspektrum (Abb. 3). Innerhalb von 600 µm Tiefe wurden 90 % des Oberflächenlichts vollständig absorbiert. Es gab einen Anstieg der skalaren Bestrahlungsstärke im Bereich von 700–800 nm, insbesondere in 100 und 200 µm Tiefe, im Vergleich zur Referenzlichtintensität in 0 µm Tiefe, was auf Fluoreszenz durch Photopigmente oder eine hohe Lichtstreuung gepaart mit geringer Absorption durch Pigmente schließen lässt diese Bandbreiten [36, 37].

Die Oberflächenbeleuchtung betrug etwa 250 µmol m-2 s−1.

Die Photogranulate hatten eine hohe Kapazität sowohl für die Sauerstoffproduktion durch Photosynthese als auch für den Sauerstoffverbrauch (Abb. 4A – C). In Gegenwart von Acetat überstieg der Sauerstoffverbrauch die Sauerstoffproduktion, was zu Anoxie im gesamten Photogranulat führte, selbst im Licht. In Abwesenheit von Acetat war das Photogranulat durchgehend mit Sauerstoff gesättigt (Abb. 4A) und wies eine maximale Sauerstoffproduktion von 738 nmol-O2 Photogranulat−1 h−1 auf, wobei die Sauerstoffproduktionsrate mit der Tiefe integriert wurde (Gleichung 1). Obwohl die Sauerstoffkonzentration in Gegenwart von Acetat niedriger war, nahm die Photosynthese nicht ab, was zu einer Kohlenstofffixierung führte, die mit der in Abwesenheit von Acetat vergleichbar war (Abb. 4E). Dies weist darauf hin, dass Sauerstoff im Photogranulat schnell und nahezu augenblicklich zirkuliert und dass die Atmung während der Acetat-Exposition trotz hoher Sauerstoffproduktion durch Photosynthese sauerstoffbegrenzt ist. Das Innere des Photogranulats ist wahrscheinlich ebenfalls lichtbegrenzt, da das Licht innerhalb des Photogranulats schnell abgeschwächt wird (Abb. 3) und somit der Großteil der lichtgesteuerten Kohlenstofffixierung im Photogranulat an den Außenkanten erfolgt (Abb. 4D, E). Dennoch lagen die höchsten Photosyntheseraten ~200 µm unter der Oberfläche des Granulats (Abb. 4C), was mit den Mikroskopbildern übereinstimmt, die eine höhere Dichte photosynthetischer Bakterien etwas unterhalb der Oberfläche des Granulats zeigen (Abb. S3 und S4). Unter Berücksichtigung eines Photogranulats mit einem Durchmesser von 4 mm wurde eine maximale Kohlenstofffixierungsrate von 383 nmol-C Photogranule−1 h−1 berechnet (Gleichung 1).

Sauerstoffprofile wurden im selben Photogranulat unter drei verschiedenen Bedingungen gemessen: unbehandeltes Leitungswasser (blaue Kreise), Wachstumsmedium ohne Acetat, aber mit Ammonium (gelbe Quadrate) und Wachstumsmedium mit Acetat und mit Ammonium (rosa Dreiecke). B Die gesamte Sauerstoffproduktion in jeder Tiefe des Photogranulats, berechnet aus den Profilen in Abbildung A, unter der Annahme eines kugelförmigen Aggregats mit 4 mm Durchmesser. C Momentane Sauerstoffproduktion, bestimmt durch die Änderung der Sauerstoffkonzentration nach 5–8 s Dunkelverschiebung, in sechs verschiedenen Tiefen, in Medien mit Ammonium, aber ohne Acetat. Die Balken stellen die mittlere Sauerstoffproduktion von 3–4 Messungen dar und die leeren Kreise stellen jede einzelne Messung dar. DA repräsentatives Mikroradiographiebild der Verteilung von 14C aus der Kohlenstofffixierung in einem Photogranulat (inkubiert mit Acetat). Der weiße Maßstabsbalken beträgt 1 mm. E Kohlenstofffixierung in Photogranulaten, die im Licht in unbehandeltem Leitungswasser (TW), mit 3 mM Acetat (TW + Ac.), mit 8 mM NH4+ (TW + N), mit 3 mM PO43− und mit beiden angereichertem Leitungswasser inkubiert wurden 8 mM NH4+ und 3 mM PO43−. Die Kohlenstofffixierung wurde durch Inkubation von Photogranulaten mit 14C-CO2 und anschließende Bestimmung der 14C-Fixierung mit einem Mikroradiographen gemessen. Die Kohlenstofffixierung wurde nach Regionen getrennt, wobei mithilfe der Aktivität Grenzen innerhalb des Aggregats markiert wurden: das Innere des Photogranulats (blau), das gesamte Photogranulat (lila) und der äußere Rand des Photogranulats (gelb). Die schwarzen Punkte stellen Messungen einzelner Photogranulate dar. Diese lichtexponierten Inkubationen wurden gleichzeitig mit Inkubationen im Dunkeln durchgeführt, die in (A) dargestellt sind. Die Ergebnisse der Inkubationen mit 3 mM und 10 mM Bicarbonat wurden kombiniert, da es keinen wesentlichen Unterschied zwischen den Gruppen gab.

Die Kohlenstofffixierung im Photogranulat war unempfindlich gegenüber kurzfristigen Änderungen der Nährstoffkonzentration (Abb. 4D). Die Kohlenstofffixierung war bei allen Photogranulaten ähnlich, die in unbehandeltem Leitungswasser, in Leitungswasser mit 3 mM Acetat, in Leitungswasser mit 8 mM Ammonium, in Leitungswasser mit 3 mM Phosphat sowie in Leitungswasser mit 8 mM Ammonium und 3 mM inkubiert wurden mM Phosphat. Dies weist darauf hin, dass die Geschwindigkeit der Kohlenstofffixierung, angetrieben durch die Photosynthese, über die gesamte Lichtphase des Reaktorchargenzyklus hinweg konstant ist. Allerdings schwankt die Geschwindigkeit der aeroben Atmung und anderer sauerstoffverbrauchender Prozesse wie der Nitrifikation aufgrund des schwankenden Kohlenstoffangebots erheblich.

Bei Dunkelinkubationen mit 14C-markiertem Carbonat, mit oder ohne Ammonium und dem Nitrifikationsinhibitor ATU erfolgte die autotrophe Nitrifikation größtenteils an den Außenkanten (0–500 µm) des Photogranulats (Abb. 5B). Die Kohlenstofffixierung war in den Inkubationen mit Ammonium am höchsten (0,9 nmol mm−3), obwohl in den Inkubationen ohne Ammonium und mit ATU immer noch eine Kohlenstofffixierung nachweisbar war. Der etwas höhere Kohlenstofffixierungsgrad (0,4 nmol mm−3) in Photogranulaten, die in unbehandeltem Leitungswasser inkubiert wurden, im Vergleich zu den Photogranulaten, die mit ATU inkubiert wurden (0,3 nmol mm−3), lässt darauf schließen, dass das Photogranulat möglicherweise etwas restliches Ammonium gespeichert oder die niedrigen Konzentrationen verwendet hat Ammonium (<0,03 mgNH4 L−1 oder <1,66 µmol L−1) im Leitungswasser verfügbar (Tabelle S1). Der höhere Grad der Kohlenstofffixierung in mit ATU inkubierten Photogranulaten im Vergleich zu toten Photogranulaten (Blank, 0,06 nmol mm−3) deutet darauf hin, dass es eine signifikante anaplerotische Kohlenstofffixierung im Photogranulat gibt (0,2 nmol mm−3).

Ein repräsentatives Mikroradiographiebild der Verteilung von 14C aus der Kohlenstofffixierung in einem mit 8 mM NH4+ inkubierten Photogranulat. B Kohlenstofffixierung in Photogranulaten, die im Dunkeln in unbehandeltem Leitungswasser (TW), mit 8 mM NH4+ (TW + N), mit 8 mM NH4+ und dem Nitrifikationsinhibitor ATU (TW + ATU) angereichertem Leitungswasser und in damit abgetöteten Photogranulaten inkubiert wurden Paraformaldehyd vor der Tracerzugabe (Blindwert). Die Kohlenstofffixierung wurde durch Inkubation von Photogranulat mit 14C-Bicarbonat und anschließende Bestimmung der 14C-Fixierung durch Mikroradiographie gemessen. Die Kohlenstofffixierung wurde nach Regionen getrennt, wobei mithilfe der Aktivität Grenzen innerhalb des Aggregats markiert wurden: das Innere des Photogranulats (blau), das gesamte Photogranulat (orange) und der äußere Rand des Photogranulats (gelb). C Der Durchschnitt von drei Mikroprofilen der Nitrat- (Kreise) und Sauerstoffkonzentrationen (Dreiecke) im selben Photogranulat, inkubiert im Licht, zuerst ohne NH4+ (orange), dann mit 100 µM NH4+ (blau), nach Erreichen des Steady-State. D Nitratproduktion in jeder Tiefe, berechnet aus den Profilen in (B), in nmol h−1, unter der Annahme eines kugelförmigen Photogranulats mit einem Radius von 1800 µm. Positive Werte weisen auf Produktionszonen hin, während negative Werte auf Verbrauchszonen hinweisen. E Momentane Sauerstoffproduktion, bestimmt durch die Änderung der Sauerstoffkonzentration nach 5–8 s Dunkelschicht, in sechs verschiedenen Tiefen, in Leitungswasser mit Ammonium. Die Balken stellen die mittlere Sauerstoffproduktion von 3–4 Messungen dar und die leeren Dreiecke stellen jede einzelne Messung dar.

Profile der Nitratkonzentrationen im Hellen und Dunkeln bestätigen teilweise die durch die dunkle Kohlenstofffixierungsverteilung vorhergesagte Verteilung der Nitrifikation (Abb. 5B, C). Während die absolute Nitratkonzentration im Zentrum des Photogranulats ihren Höhepunkt erreicht (Abb. 5B), weist die aus den gleichen Profilen berechnete volumetrische Rate der Nitratproduktion zwei Spitzen am äußeren Rand und eine relativ gleichmäßige Produktion in der Mitte auf. Diese Spitzen entsprachen einem Abfall der Sauerstoffkonzentration und einem Spitzenwert des Sauerstoffverbrauchs, der auch bei mehreren anderen Photogranulaten beobachtet wurde (Abb. 5C–E). Der Nitratverbrauch erreichte seinen Höhepunkt zwischen den Nitrifikationsspitzen und nicht im Zentrum des Photogranulats. Beachten Sie, dass der Diffusionsfluss durch eine Kugel vom Radius der Kugel abhängt (Gleichung 1), der sich mit der Tiefe ändert. Ein linearer Gradient bedeutet also nicht, dass das System durch Diffusion gesteuert wird, wie dies bei einem flachen Biofilm der Fall wäre. Um die Interpretation der Profile zu erleichtern, werden Referenzgradienten, die durch den Diffusionsfluss durch eine Kugel und eine Ebene gesteuert werden, zusammen aufgetragen (Abb. S5). Summiert man die Nitratproduktionsraten in jeder Tiefe, wurde eine Gesamtnitratproduktionsrate von 93,7 nmol Photogranule−1 h−1 (mit NH4+) und 25,1 nmol Photogranule−1 h−1 (ohne NH4+) beobachtet, was gut mit 15N-NH4+ übereinstimmt Inkubationen.

Der Stickstoffkreislauf in den Photogranulaten war abhängig von den Inkubationsbedingungen entweder sauerstoff- oder kohlenstoffbegrenzt (Abb. 6A, B). In Gegenwart von Acetat kam es aufgrund der Abwesenheit von Sauerstoff zu keiner Nitrifikation, wenn Photogranulate mit 15N-Ammonium im Dunkeln inkubiert wurden (Abb. 6A). In Gegenwart von Acetat trat im Licht eine gewisse Nitrifikation auf, was durch die Produktion von 15N-N2 angezeigt wird (schwarzer Balken, Abb. 6A), obwohl ab der Hintergrundkonzentration von 10 µM Nettonitrat verbraucht wurde (weißer Balken, Abb. 6A). . In Abwesenheit von Acetat war die Nitrifikation viel höher, insbesondere bei Inkubation im Licht (max. 150 nmol-N-Photogranulat−1 h−1) (Abb. 6B). Auch in Abwesenheit von Acetat war die Denitrifikation höher, obwohl die Photogranula in Abwesenheit von Acetat immer oxisch waren und wenig freier organischer Kohlenstoff vorhanden sein sollte (Abb. 6A). Dies weist darauf hin, dass innerhalb der Photogranulate ein erhebliches Kohlenstoffrecycling stattfindet und dass die Denitrifikation gegenüber Sauerstoff tolerant ist. Nichtsdestotrotz war die Denitrifikation in Abwesenheit von Acetat eindeutig kohlenstoffbegrenzt oder durch Sauerstoff unterdrückt, was durch die viel höhere Denitrifikationsrate in Photogranulaten angezeigt wird, die mit 15N-Nitrat im Dunkeln inkubiert wurden, mit Acetat (max. 480 nmol-N Photogranulat−1). h−1) (Abb. 6B).

A Nitrifikation (weiße Balken) und Denitrifikation (schwarze Balken) in Photogranulaten, die mit 1 mM 15N-markiertem Ammonium inkubiert wurden, entweder im Dunkeln oder im Licht und mit oder ohne Zusatz von 3 mM Acetat. Die Raten sind eine lineare Anpassung der Produktion von Nitrat und Nitrit oder 15N–N2 in 4 separaten Fläschchen, die an unterschiedlichen Punkten gestoppt werden. Die Nitrifikation stellt die Produktionsrate von extrazellulärem Nitrat und Nitrit sowie die Produktion von 15N–N2 dar. Unter Denitrifikation versteht man die Produktion von 15N-N2. Fehlerbalken geben den Standardfehler der Steigung an. B Die Denitrifikationsrate in Photogranulaten, die mit 15N–NO3– und Acetat im Dunkeln inkubiert wurden. Der Fehlerbalken stellt den Standardfehler der Steigung dar.

Das Schichtungsmuster in Photogranula ähnelte stark dem von photosynthetischen Mikrobenmatten (Abb. 1). Bewegliche filamentöse Cyanobakterien (z. B. Alkalinema pantanalense, Leptolyngbya boryana, Cephalothrix komarekiana und Limnothrix sp.) und ausgeschiedene extrazelluläre Polymersubstanzen (EPS) erzeugten ein komplexes Netz aus Filamenten, das für strukturelle Steifigkeit sorgte, ähnlich dem, was bei Cyanobakterienmatten beobachtet wurde [42, 43] . Die Vermehrung mikrobieller Gemeinschaften innerhalb von Biofilmen hängt von der EPS-Matrix ab [44]. Die Lektinfärbung zeigte, dass ein großer Anteil der Glykokonjugate in der EPS-Matrix auf D-Glucose und D-Mannose zurückzuführen war. Die Glukosebestandteile wurden wahrscheinlich von filamentösen Cyanobakterien produziert, da es sich um das dominierende Monosaccharid in der Glykokonjugatfraktion ihrer EPS-Matrix handelt [23, 45, 46]. Es wurde gezeigt, dass sowohl Glucose- (insbesondere α(1–4)-Glucane) als auch Mannose-haltige Polysaccharide eine Schlüsselrolle bei der Biofilmkohäsion sowohl in aeroben Granulaten als auch in phototrophen mikrobiellen Matten spielen [47, 48]. Die gemeldeten Lektin-spezifischen BAN-Glykokonjugate zeigen nur einen Teil der insgesamt vorhandenen Glykokonjugate. Dennoch gehen wir davon aus, dass auch andere Arten von Glykokonjugaten und Matrixverbindungen vorhanden sind, wie etwa extrazelluläre Proteine ​​und eDNA [49].

Die Bedeutung filamentöser Cyanobakterien für die Bildung von Photogranulaten wurde bereits früher hervorgehoben [12, 19, 50]. Es wurde vorgeschlagen, dass filamentöse und bewegliche Cyanobakterien zunächst einen Kern aus Filamenten (ein Bündel) bilden, der andere Organismen beherbergen kann. Mit zunehmendem Wachstum wird diese Struktur immer physikalischer und biologischer geschichtet und führt schließlich zu einem Photogranulat mit einer großen Vielfalt an Mikroumgebungen und den damit verbundenen mikrobiellen Prozessen. In natürlichen Systemen sowie in Photogranulaten erfolgt eine physikalische und biologische Schichtung entsprechend der Verfügbarkeit und dem Gradienten von Licht und Nährstoffen [8]. Während also junge und kleine Photogranula (<0,5 mm) keine definierte Struktur aufweisen, zeigen Photogranula, die auf Größen von mehreren Millimetern angewachsen sind, eine deutliche Schichtung. Andere haben auch eine mikrobielle Schichtung in großen (>2,5 mm) Photogranula beobachtet, wobei Cyanobakterien eine Schicht nahe der Oberfläche bilden [19]. In unserer Studie fanden wir heraus, dass die filamentösen Cyanobakterien unabhängig von der Größe des Photogranulats im gesamten Photogranulat vorhanden waren. Allerdings zeigten sie von der Oberfläche zur Mitte unterschiedliche Anordnungen der Filamente. Während die Cyanobakterienfilamente an der Oberfläche und in der Mitte dicht gepackt und durcheinander lagen, richteten sie sich im Bereich dazwischen radial aus. Eine Erklärung für dieses Phänomen ist die Konkurrenz um Platz innerhalb des Photogranulats, da eine radiale Anordnung der Filamente die Bewegung zwischen Regionen mit höherer Lichtexposition (Phototaxis) und höheren Anteilen anderer Substrate (Chemotaxis) erleichtern würde [43]. Dies wäre besonders nützlich, um die dicke Hülle nicht phototropher Organismen in den ersten 500 µm des Photogranulats zu „durchdringen“, dem Bereich mit der höchsten Lichtverfügbarkeit. Eine solche radiale Bewegung wurde zuvor bei Biogranulaten beobachtet, die aus Subkulturen mikrobieller Matten aus Cyanobakterien (Cephalotrix sp., früher bekannt als Phormidium sp.), Kieselalgen und heterotrophen Bakterien aus der Nordsee stammen [3]. Es wurde gezeigt, dass ihre Bewegung durch Licht und Substrate ausgelöst wird.

Die Photogranula zeigten auch eine funktionelle Schichtung ähnlich phototrophen Biofilmen in der Natur. Die Oberfläche des Photogranulats war den höchsten Licht- und Substratmengen ausgesetzt und unterstützte die höchsten photosynthetischen und nitrifizierenden Aktivitäten. In Gegenwart von Acetat beherbergte das Photogranulat anoxische Zonen, die das Auftreten anaerober Prozesse wie Denitrifikation ermöglichten. Der größte Teil der mikrobiellen Aktivität konzentrierte sich auf die äußeren 500 µm des Photogranulats. In dieser Region schwächten Phototrophe (Cyanobakterien und eukaryotische Algen) etwa 90 % des gesamten einfallenden Lichts und zeigten die höchste photosynthetische Aktivität bei etwa 400–500 µm (max. 100 nmol/h).

Zusätzlich zu der hohen Konzentration an Cyanobakterien im äußeren Teil des Photogranulats gab es auch eine große Population nicht-phototropher Organismen, darunter Nitrifikanten (Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. und Nitrospira sp.) und chemoheterotrophe Bakterien/Denitrifikatoren ( Thauera sp. und Zoogloea sp.). Diese hohe mikrobielle Dichte unterstützte eine hohe Sauerstoffproduktion/-verbrauchs- und Nitratproduktion sowie die Kohlenstofffixierung (Abb. 4 und 5). Die 14C-Inkubationen unterschätzen jedoch möglicherweise die Nitrifikationsaktivität, da sie im Dunkeln durchgeführt wurden (bei Licht wäre die Kohlenstofffixierung durch Photosynthese um Größenordnungen höher als durch Nitrifikation, Abb. 4E, 5B) und die Nitrifikation bei Licht viel höher war ( Abb. 6). Nitratprofile innerhalb des Granulats deuteten auf eine Nitrifikation in der Mitte des Granulats hin, obwohl die höchsten Raten auf den äußeren Rand (Peak ~ 200 µm) des Granulats beschränkt waren (Abb. 5D), der etwas näher an der Oberfläche liegt als bei ähnlichen -große Kryokonite (Peak ~400 µm) [5]. In ähnlicher Weise deuten auch die Sauerstoffprofile in Abwesenheit von Acetat, aber Anwesenheit von Ammonium auf eine gewisse Nitrifikation (d. h. Sauerstoffverbrauch) in der Mitte des Granulats hin, obwohl die höchsten Raten wiederum im äußeren Teil des Granulats zu verzeichnen waren (Abb. 4B und 5D). ). Dennoch wurde die im Profil beobachtete Nitratanreicherung (Abb. 5C) nicht durch erhöhte Nitrifikationsraten in geringerer Tiefe verursacht, sondern hauptsächlich durch die abnehmende Nitratverbrauchsrate zur Mitte hin. Der Nitrifikationspeak direkt unter der Oberfläche stimmt auch mit einem Modell von Photogranulaten überein, die ohne DOC, aber mit dem gleichen Ammoniumgehalt wie in dieser Studie gezüchtet wurden. Angesichts der Tatsache, dass DOC in der Hauptflüssigkeit schnell verbraucht wird, passt dieses Szenario von den modellierten Szenarien am besten zu unseren Daten [21].

Obwohl das Zentrum des Photogranulats relativ inaktiv zu sein schien, könnte es wichtige Funktionen erfüllen. Dazu können die Speicherung von Substraten (z. B. als Lipide, Stärke oder EPS), fermentative Prozesse oder die Zersetzung abgestorbener organischer Bestandteile gehören, die alle zum internen Nährstoffkreislauf im Photogranulat beitragen. Das Zentrum weist eine geringere Sauerstoffkonzentration auf und beherbergt möglicherweise weniger sauerstofftolerante Mikroben. Anaerobe Prokaryoten wie Anaerolineaceae und Caldilineaceae sowie die Pilze Trichosporon sp. Die im Photogranulat enthaltenen Substanzen können Kohlenhydrate fermentieren und organischen Phosphor und Stickstoff, die in EPS oder nekrotischer Biomasse enthalten sind, zu H2, Alkoholen (z. B. Butanol, Ethanol), Ketonen (z. B. Aceton), PO43− und NH4− mineralisieren, was wiederum können im Photogranulat wiederverwendet werden [51,52,53]. Cyanobakterien sind auch an anoxische Bedingungen angepasst und können Zucker mit sechs Kohlenstoffatomen (z. B. Glukose) beispielsweise zu Laktat oder Ethanol fermentieren [54]. Ein solcher interner Nährstoffkreislauf nimmt wahrscheinlich an Bedeutung zu, je größer das Photogranulat wird, und kann trotz externer Substratbeschränkungen Stoffwechselprozesse antreiben.

Die photosynthetische Aktivität des Photogranulats war unempfindlich gegenüber den kurzfristigen Nährstoffschwankungen, die für den Abwasser-Batch-Prozess typisch sind, obwohl andere mikrobielle Aktivitäten erheblich beeinträchtigt wurden. Durch die Kombination unserer Ergebnisse mit den aus dem Abwasserreaktor gesammelten Daten konnten wir eine Zeitleiste der sich ändernden Nährstoffbeschränkungen und Stoffwechselprozesse erstellen, die im Laufe eines Chargenzyklus auftraten (Abb. S9). Zu Beginn einer Charge waren Nährstoffe wie Ammonium (NH4+), Phosphat (PO43−) und Acetat in hohen Konzentrationen verfügbar. In dieser Phase könnten die Photogranulate hohe photosynthetische und heterotrophe Aktivitäten aufrechterhalten, was zu einem Ammonium-, Phosphat-, Acetat-, Kohlendioxid- und Sauerstoffverbrauch sowie einer Sauerstoffproduktion führt. Aufgrund der geringen Sauerstoffkonzentrationen, die durch die aerobe Atmung von Acetat erzeugt werden, fand in dieser Phase nur eine begrenzte Nitrifikation statt. Das schnelle Wachstum von Mikroorganismen während dieser Phase förderte die Aufnahme von Ammonium und Phosphor. Mit sinkenden Acetatkonzentrationen und steigenden Sauerstoffkonzentrationen kam es zu einer Nitrifikation und anschließend zu einer Denitrifikation. In der Dunkelphase schalteten die Phototrophen von der Photosynthese auf die Atmung über intern gespeicherte Photosynthesestoffe um. Die Nitrifizierung wurde fortgesetzt, bis das gesamte Ammonium in Nitrat umgewandelt war, obwohl Nitrifikanten nur 2 % der Gesamtgemeinschaft ausmachten. Da das gesamte Acetat bereits verbraucht war, wurde die Denitrifikation durch intrazellulär gespeicherten Kohlenstoff (z. B. als Polyhydroxyalkanoate) [55] oder intern recycelten Kohlenstoff durch Zersetzung organischer Stoffe [56] vorangetrieben, konnte jedoch aufgrund der Kohlenstoffbegrenzung nicht das gesamte Nitrat vollständig entfernen.

Die 15N-Inkubationen zeigten, dass es auch unter oxischen Bedingungen zu Denitrifikation kommen kann. Daher wurde die Denitrifikation wahrscheinlich teilweise durch den aeroben Denitrifizierer Thauera sp. durchgeführt. [57]. Darüber hinaus zeigten die Inkubationen, dass der intern zirkulierende organische Kohlenstoff (z. B. organischer Kohlenstoff aus Phototrophen oder intern gespeicherter und recycelter Kohlenstoff) auch in Abwesenheit von Acetat die Denitrifikation aufrechterhalten kann (Abb. 6A). Verglichen mit der maximalen Denitrifikationsrate bei Zugabe von Acetat im Dunkeln war die Denitrifikationsrate bei intern zirkuliertem Kohlenstoff etwa 25-mal niedriger (Abb. 6B). Dennoch reichten diese Raten aus, um in der Dunkelphase weiterhin Stickstoff aus dem Bioreaktor zu entfernen.

Das grundlegende Wissen darüber, wie Photogranulate aufgebaut sind und funktionieren, wird es Ingenieuren ermöglichen, dieses neuartige Ökosystem für die Abwasserbehandlung nachzubilden. In unserer Studie untersuchten wir eine aktive phototrophe, nitrifizierende und denitrifizierende Gemeinschaft, die hohe Stickstoff- und Kohlenstoffentfernungs-/-umwandlungsraten aufwies und intern verknüpfte Prozesse (Austausch von Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid) aufwies.

Die Einführung einer phototrophen Gemeinschaft in den Abwasserbehandlungsprozess wird letztendlich die Schließung der CO2- und Sauerstoffkreisläufe des herkömmlichen Belebtschlammprozesses ermöglichen. Sauerstoff würde durch Photosynthese und CO2 durch die heterotrophe Umwandlung organischer Stoffe erzeugt, wodurch eine externe Sauerstoffzufuhr überflüssig wäre. Die Sauerstoffproduktion und der Sauerstoffverbrauch im Aggregat wurden mit 13,6 mmol L−1 d−1 bzw. 13,1 mmol L−1 d−1 berechnet (Gleichung S1–S4), was zu einer Nettosauerstoffproduktion führte. Der durch die Photosynthese erzeugte Sauerstoff wird schnell durch Verbrauchsprozesse verbraucht, was im Aggregat eng gekoppelte Prozesse zeigt. Zu Beginn des Chargenzyklus, als noch Acetat vorhanden war, war das Photogranulat sauerstofflimitiert, d. h. die Photosynthese konnte die heterotrophe Atmung und Nitrifikation nicht mit ausreichend Sauerstoff versorgen, um maximale Raten zu erreichen (Abb. 4A). Dies zeigte sich auch an der stündlichen Sauerstoffproduktionsrate von 1,1 mmol L−1 h−1 und der Sauerstoffverbrauchsrate von 1,4 mmol L−1 h−1 in den ersten 4 Stunden des Zyklus (unter Berücksichtigung der vollständigen Entfernung von Acetat nach 4 Stunden). des Kreislaufs und hohe Nitrifikationsaktivität). Nachdem das Acetat vollständig verbraucht war, würde die Photosynthese ohne externe CO2-Zufuhr wahrscheinlich kohlenstofflimitiert werden. Um den Sauerstoffbedarf gegenüber der Sauerstoffproduktion in einem System ohne externe Sauerstoff- oder CO2-Zufuhr zu optimieren, könnten die Lichtzufuhr und die spezifische Acetatbelastung geändert werden. Dies ist besonders wichtig, wenn sich die Abwassereigenschaften (N, P, CSB) oder die Lichtverhältnisse ändern.

Wie bereits erwähnt, fand die meiste Aktivität aufgrund der Lichteindringung und der Einschränkung der Nährstoffdiffusion am Rand (äußere 500 µm) des Photogranulats statt. Die in dieser Studie untersuchten Photogranulate (2–4 mm) enthielten dabei eine beträchtliche relativ inaktive Zone, die die Gesamtumwandlungsrate eines einzelnen Photogranulats verringerte. Kleinere Größen würden die Umwandlungsrate pro einzelnem Photogranulat optimieren und könnten folglich die maximale Umwandlungsrate eines Photogranulat-Behandlungssystems erhöhen. In früheren Studien wurde eine ideale Granulatgröße von 1,25–1,5 mm für aerobe Granulat [58, 59] und 0,5–1,7 mm für Photogranulat [19] ermittelt. Während die Licht- und Kohlenstoffbelastung des Systems die Photogranulatgröße beeinflusst, steuert die Feststoffretentionszeit (SRT) letztendlich die Größe des Photogranulats, da sie eine Obergrenze für das Alter eines Photogranulats darstellt. Eine kürzere SRT würde zu kleineren Körnchen und höheren photogranulaspezifischen Umwandlungsraten führen, könnte jedoch für einige langsam wachsende Organismen (z. B. Nitrifikatoren) schädlich sein und die Absetzbarkeit der Photogranula beeinträchtigen, wenn die Granulatgrößen zu klein werden (<0,5 mm) [60]. Daher muss die Granulatgröße sorgfältig unter Berücksichtigung all dieser verschiedenen Aspekte bewertet werden.

Schließlich deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Betriebsbedingungen des Reaktors geändert werden müssen, um die Nitrifikationsraten weiter zu erhöhen. Die Nitrifikation wurde stark durch die Verfügbarkeit von Sauerstoff gesteuert, wobei die Raten im Licht drei- bis viermal höher waren als im Dunkeln (Abb. 6A). In Gegenwart von Acetat ist zu erwarten, dass die Nitrifikation vollständig gehemmt wird, da das gesamte Photogranulat unter dieser Bedingung anoxisch war. Dennoch entfernten Photogranulate während des Reaktorbetriebs immer vollständig Ammonium aus dem Überstand, sowohl wenn die Charge mit einem Lichtzyklus begann, als auch wenn sie mit einem Dunkelzyklus begann. Da der Acetatverbrauch etwa 4 Stunden dauert (Abb. S8), wären die Bedingungen für eine optimale Nitrifikation in einem Zyklus, der mit einer leichten Phase beginnt, nur etwa 2 Stunden lang gegeben. Im Gegensatz dazu wäre in einem Zyklus, der mit einer Dunkelphase beginnt, in der das gesamte Acetat verbraucht wird, die Nitrifikation für volle 6 Stunden optimiert. Dies weist darauf hin, dass im Zyklus, beginnend mit einer Dunkelphase, erhebliche ungenutzte Nitrifikationskapazitäten vorhanden sind. Zu diesem Zeitpunkt könnte ein zusätzlicher, teilweiser Austausch der Reaktorflüssigkeit unterstützt werden, um die Reaktoraktivität zu erhöhen. Dies würde auch die Denitrifizierung von mehr umgewandeltem Nitrat ermöglichen, das ansonsten kohlenstofflimitiert ist, da das meiste Nitrat nach der Entfernung des Acetats entsteht (Abb. 6B, S8). Eine andere Möglichkeit wäre, eine externe Kohlenstoffquelle (z. B. Methanol, Acetat oder Melasse) zu pulsieren, um eine kohlenstoffbegrenzte Denitrifikation zu fördern, was in herkömmlichen Abwasseraufbereitungsanlagen eine gängige Praxis ist [61].

Photogranules enthalten komplette Ökosysteme in nur wenigen Kubikmillimetern. Ein Gerüst aus beweglichen filamentösen Cyanobakterien und EPS unterstützt eine Vielzahl von Phototrophen und Heterotrophen, die zur Nitrifikation, Denitrifikation, Photosynthese, aeroben Atmung und Phosphataufnahme fähig sind. Diese vielfältige Gemeinschaft zirkuliert intern mindestens drei Nährstoffe, die für die Abwasserbehandlung wichtig sind: Sauerstoff, Stickstoff und Kohlenstoff. Sauerstoff aus der Photosynthese wird durch aerobe Atmung und Nitrifikation in Gegenwart von Acetat bzw. Ammonium sofort verbraucht. Nitrifizierer wandeln Ammonium in Nitrat und Nitrit um, das anschließend schnell denitrifiziert wird. Durch Photosynthese fixierter organischer Kohlenstoff wird verwendet, um die Denitrifizierung nach dem Acetatabbau voranzutreiben. Die Bedingungen innerhalb des Photogranulats variieren im Laufe der Zeit dramatisch, von völlig anoxischen bis zu Sauerstoffkonzentrationen, die dreimal über der Sättigung liegen, mit noch größeren Schwankungen bei der Verfügbarkeit von Nitrat und organischem Kohlenstoff. Dennoch behalten Photogranulate ein hohes, robustes Aktivitätsniveau bei, unterstützt durch ein dichtes Netzwerk miteinander verbundener Zellen, die Nährstoffe austauschen. Dieses dichte Netzwerk und der Nährstoffaustausch ermöglichen eine Denitrifikation ohne externen organischen Kohlenstoff, geringe Nitrifikationsmengen ohne die Bereitstellung von externem Ammonium und eine Nitrifikation unter nahezu anoxischen Bedingungen. Photogranulate bieten somit die Möglichkeit, die Sonnenenergie zur Reinigung von Abwasser zu nutzen und den Energiebedarf der herkömmlichen Abwasserbehandlung zu senken, indem die Notwendigkeit einer Belüftung von Behandlungsreaktoren verringert oder beseitigt wird.

Die Rohdaten der 16S- und 18S-rRNA-Gensequenzen sind in der EBI-Datenbank unter der Projektnummer PRJEB54633 verfügbar. Die anderen Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Ute Kuhlicke vom UFZ Magdeburg für ihre hervorragende Unterstützung bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, den Technikern der Mikrosensorgruppe am MPI in Bremen für ihre Hilfe und der Herstellung von Mikrosensoren und Elisa Merz für ihre Hilfe bei der 15N-Inkubation Messungen. Diese Forschung wurde von der Dutch Technology Foundation (STW) unter der Fördernummer STW-15424 unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lukas M. Trebuch, Olivia M. Bourceau.

Abteilung für Aquatische Ökologie, Niederländisches Institut für Ökologie (NIOO-KNAW), Droevendaalsesteeg 10, 6708 PB, Wageningen, Niederlande

Lukas M. Trebuch, Stijn MF Vaessen und Tania V. Fernandes

Bioverfahrenstechnik, AlgaePARC Wageningen University, Postfach 16, 6700 AA, Wageningen, Niederlande

Lukas M. Trebuch, Stijn MF Vaessen, Marcel Janssen und René H. Wijffels

Mikrosensor-Forschungsgruppe, Max-Plank-Institut für Marine Mikrobiologie, Celsiusstraße 1, 28359, Bremen, Deutschland

Olivia M. Bourceau & Dirk of Beer

Grenzflächenmikrobiologie, Abteilung Flussökologie, Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung - UFZ, Brückstraße 3A, 39114, Magdeburg, Deutschland

Thomas R. Neu

Abteilung für terrestrische Ökologie, Niederländisches Institut für Ökologie (NIOO-KNAW), Droevendaalsesteeg 10, 6708 PB, Wageningen, Niederlande

Louise EM Tierarzt

Fakultät für Biowissenschaften und Aquakultur, Nord University, N-8049, Bodø, Norwegen

René H. Wijffels

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LMT: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Schreiben – Originalentwurf; OMB: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Schreiben – Originalentwurf; SMFV: Methodik, Untersuchung; TRN: Methodik, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; MJ: Betreuung, Konzeptualisierung, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten; DB: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten; RHW: Betreuung, Schreiben, Rezension und Bearbeitung; LMV: Betreuung, Finanzierungseinwerbung, Schreiben – Überprüfen und Lektorieren; TVF: Betreuung, Konzeptualisierung, Finanzierungseinwerbung, Schreiben, Begutachtung und Redaktion

Korrespondenz mit Lukas M. Trebuch.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Trebuch, LM, Bourceau, OM, Vaessen, SMF et al. Hochauflösende Funktionsanalyse und Gemeinschaftsstruktur von Photogranulaten. ISME J 17, 870–879 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01394-0

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Eingegangen: 30. Juli 2022

Überarbeitet: 28. Februar 2023

Angenommen: 03. März 2023

Veröffentlicht: 30. März 2023

Ausgabedatum: Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01394-0

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