Identifizierung von Pilz-Lignozellulose

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1254 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das aktivitätsbasierte Proteinprofiling (ABPP) hat sich zu einer vielseitigen biochemischen Methode zur Untersuchung der Enzymaktivität unter verschiedenen physiologischen Bedingungen entwickelt und findet bisher hauptsächlich Anwendung in der Biomedizin. Hier zeigen wir das Potenzial von ABPP bei der Entdeckung von Biokatalysatoren aus dem thermophilen und Lignocellulose abbauenden Weißfäulepilz Phanerochaete chrysosporium. Mithilfe eines vergleichenden ABPP-basierten Funktionsscreenings, einschließlich einer direkten Profilierung holzsubstratgebundener Enzyme, identifizieren wir die lignocelluloseabbauende Kohlenhydratesterase (CE1 und CE15) und die Glycosidhydrolase (GH3, GH5, GH16, GH17, GH18, GH25). GH30, GH74 und GH79) Enzyme, die spezifisch in Gegenwart des Substrats aktiv sind. Da die Expression von Pilzenzymen weiterhin eine Herausforderung darstellt, stellt unser ABPP-vermittelter Ansatz ein Vorauswahlverfahren dar, um die experimentellen Bemühungen auf die vielversprechendsten Biokatalysatoren zu konzentrieren. Darüber hinaus kann dieser Ansatz auch die funktionale Annotation von Domänen unbekannter Funktionen (DUFs) ermöglichen. Das hier beschriebene ABPP-basierte Biokatalysator-Screening könnte somit die Identifizierung aktiver Enzyme in einem interessierenden Prozess und die Aufklärung neuer Biokatalysatoren ermöglichen, die keine Sequenzähnlichkeit mit bekannten Gegenstücken aufweisen.

Das aktivitätsbasierte Proteinprofiling (ABPP) hat sich zu einer weit verbreiteten Methode der chemischen Proteomik für die biologische Grundlagenforschung entwickelt1,2,3,4,5. Bei ABPP handelt es sich um aktivitätsbasierte Sonden (ABPs), die aus einem reaktiven „Gefechtskopf“, einer enzymhemmenden Einheit, die eine kovalente irreversible Bindung mit ihrem/ihren Zielprotein(en) eingeht und oft eine hohe Enzymklassenspezifität gewährleistet, einem Linker und einem Reporter bestehen Tag werden zur Markierung, Identifizierung und Meldung aktiver Enzyme unter nativen, physiologischen Bedingungen verwendet. Als Reporter werden häufig Biotin, Fluorophore oder sogenannte Two-Step-Reporter-Tags wie Alkin- oder Azideinheiten verwendet6. In den letzten Jahren wurden intensive Anstrengungen unternommen, um sowohl neue ABPs zu entwickeln, die auf neue Enzymfamilien abzielen, als auch ihre Verwendung unter anderem in der Arzneimittelforschung (Target- und Lead-Entdeckung, Target-Engagement) zu etablieren7,8,9,10,11 ,12, Pflanzenbiologie13 oder Mikrobiologie14,15,16,17,18.

Eine sich entwickelnde alternative ABPP-Anwendung ist ihre Verwendung im Biokatalysator-Screening und damit in der Biotechnologie (wir definieren Biokatalysatoren hier als Enzyme mit potenzieller industrieller Nutzung)19,20,21. Beispielsweise kann ABPP verwendet werden, um mikrobielle Biokatalysatoren zu entdecken, die in der Lage sind, komplexe polymere Biomasse wie Lignozellulose umzuwandeln, Einheiten, die im Zusammenhang mit nachhaltiger Energie und zirkulären Bioökonomieprozessen sehr gesucht sind22,23,24. Im Gegensatz zu sequenzhomologiebasierten Biokatalysator-Screening-Ansätzen (z. B. der Analyse genomischer Daten25) nutzt ABPP die etablierte Enzymselektivität von ABPs, um neue Biokatalysatoren mit wünschenswerten Substratpräferenzen zu identifizieren, im Prinzip ohne die Notwendigkeit, Sequenzhomologien zuzuweisen (Abb . 1a)26,27. Bei der sogenannten „ABP-basierten Anreicherung“ werden nur diejenigen Enzyme für die anschließende Identifizierung durch LC-MS/MS-basierte Sequenzierung ausgewählt, die aktiv sind und daher die Fähigkeit haben, mit einem ABP zu reagieren, was die Proteinidentifizierung entsprechend dem Ziel einschränkt Spezifität der verwendeten ABPs. Dementsprechend ist die oft umständliche biochemische Proteinexpression und -reinigung auf nur die durch ABPP vorselektierten Biokatalysatoren beschränkt – eine enorme Arbeitsersparnis im Vergleich zu Screening-Methoden, die auf systematischer Proteinexpression basieren. Dies ist besonders relevant bei Screening-Kampagnen für Pilzbiokatalysatoren, die häufig durch eine schwierige heterologe Proteinexpression und -reinigung behindert werden, z. B. aufgrund komplexer Glykosylierungsmuster im Fall holzabbauender Enzyme28,29. Trotz dieser intrinsischen Fortschritte wurde die Entdeckung von ABPP-basierten Biokatalysatoren hauptsächlich in Proof-of-Concept-Studien unter Verwendung von Reinkulturen, häufig von Modellorganismen, und, was noch wichtiger ist, von Standardkulturmedien für deren Wachstum30,31,32,33,34 angewendet .

a Überblick über den ABPP-Workflow zur Identifizierung lignozelluloseabbauender Enzyme aus P. chrysosporium-Suspensionskulturen, die auf Minimalmedium mit Buchenholzspänen gezüchtet wurden. Nach der Lyophilisierung wird entweder dem Filtrat einer P. chrysosporium-Buchenholzkultur (als Überstand bezeichnet) oder der mit Dodecylmaltosid solubilisierten substratgebundenen Fraktion (als SBF bezeichnet) ein ABP zugesetzt. Auf die Vorbehandlung folgt ein standardmäßiger ABPP-Arbeitsablauf, bestehend aus der Klick-Anbindung eines Biotinrests zur Affinitätsanreicherung (im Falle eines zweistufigen ABP), der Affinitätsanreicherung markierter Enzyme, dem Trypsinverdau und der anschließenden MS-basierten Proteinidentifizierung . Der Einsatz enzymklassenspezifischer ABPs führt daher zur gezielten Identifizierung aktiver Biokatalysatoren und damit zum funktionellen Enzymscreening und ermöglicht darüber hinaus die sequenzunabhängige Identifizierung neuer Biokatalysatoren ohne Ähnlichkeit zu bekannten homologen. Das Einlassbild zeigt, wie sich P. chrysosporium während des Lignozelluloseabbaus an die Massivholzoberfläche bindet. b Chemische Strukturen der in dieser Studie verwendeten ABPs und Konkurrenten. Dabei handelt es sich um FP-Alkin (das „klassische“ Serinhydrolase-ABP) und JJB111 (GH ABP), sowie den FP-Konkurrenten Paraoxon und die JJB111-Konkurrenten KY371 und KY358. c Lignozellulose ist ein komplexes und widerspenstiges Polymer, das aus Zellulose, Xylan (Hemizellulose) und Lignin aufgebaut ist. Sein Abbau erfordert die synergistische Wirkung verschiedener Enzyme.

In der vorliegenden Studie wollten wir diese Einschränkung überwinden und das Potenzial der ABPP-Biokatalysator-Screening-Technologie in einem komplexeren und biotechnologisch relevanteren experimentellen Umfeld demonstrieren. Dementsprechend haben wir ABPP auf eine suspendierte Kultur angewendet, die aus dem Weißfäulepilz Phanerochaete chrysosporium besteht, der auf Minimalmedium und festen Buchenholzspänen als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle gewachsen ist, ähnlich wie bei jüngsten Arbeiten zu einem funktionellen ABPP-Ansatz bei einer Reihe von Basidiomyceten35. Lignozellulose ist der Hauptbestandteil von Totholz und stellt einen äußerst widerspenstigen Polymerkomplex dar, der aus Zellulose, Xylan (Hemizellulose) und Lignin aufgebaut ist (Abb. 1b)36. Nachhaltige Methoden für den effizienten Abbau werden dringend gesucht, um eine biotechnologische Umwandlung von Non-Food-Biomasse in einen industriellen Rohstoff zu etablieren37,38,39. Dies erfordert jedoch eine synergistische Wirkung verschiedener Biokatalysatoren wie Glycosidhydrolasen (GHs), Kohlenhydratesterasen (CEs), Polysaccharidlyasen und anderer Enzyme, die zur Klasse der Hilfsenzyme (Auxiliary Activities, AAs) gehören, wie beispielsweise lytische Polysaccharidmonooxygenasen ( LPMOs)40,41,42. P. chrysosporium ist ein wirksamer Abbauer von Totholz und insbesondere von Lignozellulose43. Sein Genom beherbergt ein großes Repertoire an lignocellulolytischen Enzymen, das aus mehr als 69 verschiedenen Familien kohlenhydrataktiver Enzyme (CAZyme) besteht, darunter insgesamt 166 GHs, 14 CEs und 57 Glykosyltransferasen (GT) (wie in der CAZY-Datenbank aufgeführt (www.cazy.org). cazy.org44)45. Diese enorme Komplexität macht diesen Organismus zu einer vielversprechenden Ressource für die Entdeckung von Biokatalysatoren. Aufgrund seiner schieren Größe kann das Sekretom von P. chrysosporium jedoch nicht durch systematische Expression aller Enzyme erforscht werden. Stattdessen ist eine Methode zur Vorauswahl nur dieser erforderlich Es sind Enzyme erforderlich, die direkt am Lignozelluloseabbau beteiligt sind. Bemerkenswert ist, dass die Expression dieser Biokatalysatoren durch das Vorhandensein des Lignozellulosesubstrats reguliert wird, was Vorauswahltests in Gegenwart unlöslicher Holzspäne und damit sehr heterogener Bedingungen erfordert46.

Mit dem Ziel, aus diesem komplexen System mittels ABPP-basierter Vorauswahl schnell vielversprechende Lignocellulose abbauende Enzyme zu identifizieren, verwendeten wir FP-Alkin, ein gut etabliertes Serinhydrolase (SH)-abzielendes ABP47,48 und die beiden strukturell verwandten GH- Targeting der ABPs KY371 (N-Alkinyl-Cyclophellitol-Aziridin) und JJB111 (das Biotin-Äquivalent von KY371)49,50 auf P. chrysosporium-Kulturen, die in Minimalmedium mit Buchenholzspänen als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle gezüchtet wurden (Abb. 1c). FP-Alkin ist ein Reporter-markiertes Derivat der bekannten Fluorphosphonat-Serinhydrolase-Inhibitoren und bindet daher spezifisch alle SHs, d. h. Serinproteasen und metabolische SHs, ohne Spezifität innerhalb dieser Enzymklasse51. Im Gegensatz dazu ist JJB111 ein Aziridin-Analogon von Cyclophellitol, einem Naturprodukt-Inhibitor von GHs. JJB111 ahmt strukturell β-Glucopyranosid-Einheiten nach und reagiert daher bevorzugt mit zurückhaltenden β-Glucosidasen49; Darüber hinaus markiert es jedoch auch eine Vielzahl von β-Exoglykosidasen52,53. Beim Abbau von Hemicellulose spalten die Acetyl-Xylan-Esterasen, darunter Mitglieder der SH-Familie, als einen der ersten Schritte im gesamten Abbauweg Acetylgruppen vom Kohlenhydrat-/Polysaccharid-Rückgrat ab54. Die GHs wiederum sind für die Hydrolyse von Cellulose, Pektin und Xylan verantwortlich. Zusätzlich zu den extrazellulären löslichen Enzymen, die im Kulturüberstand gefunden werden, haben wir unseren ABPP-Ansatz auch auf substratgebundene Enzyme angewendet, die aus Holzspänen isoliert wurden. Unsere Ergebnisse zeigen somit, dass ABPP eine unkomplizierte und technisch einfache gezielte Identifizierung aktiver Biokatalysatoren ermöglicht, einschließlich Enzymen mit bisher nicht annotierten Gensequenzen (bestehend aus Domänen unbekannter Funktion (DUF)), direkt aus Pilz-/Mikrobenkulturen, die auf komplexen lignozellulosehaltigen Substraten gezüchtet wurden.

Frühere Studien zur Identifizierung von Lignocellulose abbauenden Enzymen von P. chrysosporium wurden mittels „klassischer“ vollständiger Proteomanalysen von Kulturüberständen durchgeführt55. Um das Potenzial von ABPP bei der schnellen Identifizierung lignocellulolytischer Enzyme zu demonstrieren, haben wir P. chrysosporium-Kulturen (DSM 1566) 5 Tage lang bei 37 °C in Buchenholzspänen enthaltendem Minimalmedium gezüchtet (Abb. 2a). Die Bildung von Pilzhyphen sowie der makroskopische Abbau von Wachstumssubstraten in einer getauchten Flüssigkultur bestätigten ein effizientes Pilzzellwachstum unter diesen Bedingungen. Der Kulturüberstand wurde filtriert, lyophilisiert, erneut in Puffer aufgelöst und dann mit 2 µM der beiden ABPs FP-Alkin bzw. JJB111 markiert. Für kompetitive ABPP-Experimente wurde eine Vorbehandlung mit entweder 50 µM Paraoxon im Fall von FP-Alkin oder 20 µM KY358 im Fall der JJB111-Markierung verwendet. Nach der Affinitätsanreicherung wurde die Zielidentifizierung durch tryptische Verdauung auf den Kügelchen und LC-MS/MS-Analyse erreicht. Jedes identifizierte Protein wurde mithilfe einer auf der spektralen Intensität basierenden relativen Quantifizierung quantifiziert. Als Referenz wurden mit DMSO oder entsprechenden Konkurrenzprodukten behandelte Proben verwendet. In allen ABPP-basierten Markierungsexperimenten wurden nur Proteingruppen mit einer log2-fachen Änderung (FC) von ≥2 für die weitere Analyse aufbewahrt.

ein Workflow der Analyse. P. chrysosporium-Suspensionskulturen wurden 5 Tage lang auf einem mit Buchenholzspänen ergänzten Minimalmedium gezüchtet. Der Feststoff wurde abfiltriert, das Filtrat lyophilisiert und der Rückstand einer ABPP mit den entsprechenden Sonden unterzogen. b ABPP von SHs ohne (linkes Feld, log2-fache Änderung ≥2 im Vergleich zu DMSO ist angegeben) oder nach Vorbehandlung mit 50 µM Paraoxon (Konkurrenzexperiment, rechtes Feld) mit 2 µM FP-Alkin nach Click-Chemie (n = 4 biologisch). unabhängige Stichproben). Grüne Punkte zeigen SHs an. c ABPP von GHs ohne (linkes Feld, log2-fache Änderung ≥2 im Vergleich zu DMSO ist angegeben) oder nach Vorbehandlung mit 20 µM KY358 (Konkurrenzexperiment, rechtes Feld) mit 2 µM JJB111 (n = 4 biologisch unabhängige Proben). Blaue Punkte zeigen GHs an, während der rote Punkt das DUF-Protein mit vier Domänen unbekannter Funktion Phchr2|3002168 mit potenzieller GH-Aktivität darstellt.

Für die FP-Alkin-Behandlung führte dieser Ansatz zur Identifizierung von zwei SHs mit der Joint Genome Institute (JGI)-Protein-ID Phchr2|126075 (vorhergesagte Kohlenhydratesterase-Familie 1 (CE1) mit einer CBM1-Domäne, MW von 35,6 kDa) und Phchr2 |2912243 (vorhergesagte Kohlenhydratesterase-Familie 15 (CE15), MW von 44,3 kDa) (Tabelle 1 und grün markierte Proteine ​​in Abb. 2b; siehe Ergänzende Daten 1 für die vollständige Liste der identifizierten Proteine). Phchr2|126075 weist eine hohe Sequenzähnlichkeit zu einer zuvor untersuchten Acetyl-Xylan-Esterase von P. chrysosporium auf und seine Markierung wurde durch Vorbehandlung mit dem Esterase-Inhibitor Paraoxon56 kompensiert. Im Gegensatz dazu legt die Sequenzanalyse von Phchr2|2912243 nahe, dass es sich bei diesem Enzym um ein Mitglied der CE15-Familie und daher wahrscheinlich um eine 4-O-Methylglucuronoylmethylesterase handelt.

Die Anwendung von JJB111 ermöglichte die Identifizierung von zwölf GHs (Tabelle 1 und blau markierte Proteine ​​in Abb. 2c; die vollständige Liste der identifizierten Proteine ​​finden Sie in den Zusatzdaten 2). Die Vorbehandlung mit KY358 konkurrierte mit der Markierung von sechs von ihnen, die zu den Familien GH3, GH5, GH16 und GH74 gehören. Interessanterweise ergab unsere Analyse im Gegensatz zu den identifizierten GHs, von denen bekannt ist, dass sie am Abbau von Cellulose (GH3 und GH5), Xylan (GH3) oder Xyloglucan (GH74) beteiligt sind, auch eine signifikante Anreicherung (log2-fache Änderung: 5,39) des Proteins Phchr2| 3002168, das in der JGI-MycoCosm-Genomdatenbank45 als Glutaminase gekennzeichnet ist (Tabelle 1 und rot markiertes Protein in Abb. 2c). Die Markierung von Phchr2|3002168 wurde durch Vorinkubation mit KY358 kompetiert und die Domänenanalyse seiner Proteinsequenz durch PFAM57 und InterProScan58 ergab das Vorhandensein von vier DUF-Domänen (DUF4964, DUF5127, DUF4965 und DUF1793) zusammen mit einem Sekretionssignal (ergänzende Abbildung). . 1a). Die Strukturhomologieanalyse von HHpred59 sagte jedoch eine β-Glucosidase der GH116-Familie aus Thermoanaerobacterium xylolyticum (pdb-Code 5O0S60, e-Wert von 7,2e−34, 14 % Sequenzidentität) und eine GH52-Xylosidase aus Geobacillus thermoglucosidasius (pdb-Code 4C1O61, e -Wert von 7.1e−31, 10 % Sequenzidentität) als homologe Proteine ​​(ergänzende Abbildung 1b). Darüber hinaus deutete die Analyse mit InterProScan auf das Vorhandensein einer Glykosidasedomäne mit sechs Haarnadeln hin, die für Mitglieder der GH15-, GH65-, GH92- und GH116-Familie charakteristisch ist. Die von Alphafold62 vorhergesagte 3D-Struktur von Phchr2|3002168 zeigte eine hohe Sekundärstrukturüberlappung mit der GH52-β-Xylosidase 4C1P ((α/α)6 Barrel) von 70 %, trotz ihrer geringen Sequenzähnlichkeit von 12 % (ergänzende Abbildung 1c, D). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Phchr2|3002168 ein GH einer bisher nicht charakterisierten GH-Familie sein könnte.

Unsere bisherige Studie zeigt, dass ABPP zum Nachweis aktiver SH- und GH-Enzyme im Pilzkulturüberstand verwendet werden kann. Allerdings sind am Lignozelluloseabbau durch P. chrysosporium eine Vielzahl von Enzymen beteiligt, die sich teilweise an das jeweilige kohlenhydratbasierte Substrat anlagern63. Naturgemäß sind diese substratgebundenen Enzyme für biotechnologische Anwendungen von besonderem Interesse, da sie direkt am Lignocelluloseabbau beteiligt sind. Während der Probenvorbereitung wurde das Lignozellulosesubstrat abfiltriert, um ein homogenes Ausgangsmaterial für die Markierung zu erhalten. Tatsächlich wird ein solcher Verwerfungsschritt häufig in verschiedenen funktionellen Screening-Ansätzen durchgeführt, und ein technisch einfacher Ansatz zur gezielten Analyse substratgebundener Biokatalysatoren wäre äußerst wünschenswert.

Um zu untersuchen, ob solche Enzyme durch einen substratorientierten ABPP-Ansatz nachgewiesen werden können, haben wir erneut P. chrysosporium in Gegenwart von Buchenholzspänen gezüchtet. Nach Entfernung des Kulturüberstands und freier Pilzzellen wurden die aktiven substratgebundenen Enzyme mit 0,1 % (w/v) des MS-kompatiblen Detergens Dodecyl-β-d-maltosid abgelöst. Die abgetrennten Proteine ​​wurden dann lyophilisiert und der Rückstand in Puffer aufgelöst, gefolgt von der Zugabe der ABPs und dem standardmäßigen nachgeschalteten MS-Probenvorbereitungs- und Analyse-Workflow (Abb. 3a).

a Workflow der SBF-Analyse. P. chrysosporium-Suspensionskulturen wurden 5 Tage lang auf einem mit Buchenholzspänen ergänzten Minimalmedium gezüchtet. Die Buchenholzspäne wurden isoliert und substratgebundene Proteine ​​wurden durch Behandlung mit 0,1 % (Gew./Vol.) Dodecylmaltosid isoliert. Die erhaltene Proteinlösung wurde lyophilisiert und der Rückstand einer ABPP mit den entsprechenden Sonden unterzogen. b ABPP von SHs ohne (linkes Feld, log2-fache Änderung ≥2 im Vergleich zu DMSO ist angegeben) oder nach Vorbehandlung mit 50 µM Paraoxon (Konkurrenzexperiment, rechtes Feld) und 2 µM FP-Alkin nach Klick-Chemie (n = 4 biologisch unabhängig). Proben). Grüne Punkte zeigen kommentierte CEs an. c ABPP von GHs ohne (linkes Feld, log2-fache Änderung ≥2 im Vergleich zu DMSO ist angegeben) oder nach Vorbehandlung mit 20 µM KY371 (Konkurrenzexperiment, rechtes Feld) mit 2 µM JJB111 (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Blaue Punkte zeigen mit Anmerkungen versehene GHs an.

Der Einsatz von FP-Alkin führte zur Identifizierung von 53 substratgebundenen Proteinen, von denen siebzehn mit einer log2-fachen Änderung ≥2 angereichert waren. Ihre funktionelle Anmerkung ergab das Vorhandensein von vier CEs aus den CE1- und CE15-Familien (Tabelle 2 und grün markierte Proteine ​​in Abb. 3b; die vollständige Liste der identifizierten Proteine ​​finden Sie in den Zusatzdaten 3). Bemerkenswert ist, dass nur die Markierung der Proteine ​​der CE1-Familie Phchr2|2983171 und Phchr2|126075 durch Vorinkubation mit Paraoxon erfolgreich gehemmt wurde. Diese Proteine ​​sind aufgrund ihres vorhergesagten Potenzials als Acetyl- oder Feruloylesterasen von potenziellem biotechnologischem Interesse. Darüber hinaus wurden fünf Serincarboxypeptidasen (S10) und vier Carboxylesterasen identifiziert, die möglicherweise eine Rolle bei der Enzymaktivierung während des Lignocelluloseabbaus spielen, beispielsweise von Cellobiose-Dehydrogenasen64. Die Markierung von drei der angereicherten Carboxylesterasen wurde außerdem durch Paraoxon konkurriert.

Die Analyse des ABPP-Ansatzes mit JJB111 ergab sieben GHs, die mit einem log2-FC ≥2 angereichert waren (blau markierte Proteine ​​in Abb. 3c, die vollständige Liste der identifizierten Proteine ​​finden Sie in den Zusatzdaten 4). Davon wurden vier durch Vorinkubation mit KY371 konkurriert. Die Proteine ​​Phchr2|3002242, Phchr2|2945552 und Phchr2|3003144 sind vorhergesagte Mitglieder der GH3-Familie, während Protein Phchr2|2915237 zur GH5-Unterfamilie 9 gehört; Von beiden GH-Familien ist bekannt, dass sie den Abbau von Cellulose oder Xylan katalysieren. Im Gegensatz dazu konkurrierte KY371 nicht mit der Markierung der Proteine ​​Phchr2|3004009 (GH17), Phchr2|2895579 (GH5) und Phchr2|3038646 (GH25). Bemerkenswert ist, dass drei der identifizierten Proteine ​​(dh Phchr2|291537, Phchr2|126075 und Phchr2|2912243) auch in der ABPP-Analyse des Überstands identifiziert wurden.

Insgesamt zeigen diese Experimente, dass ABPP nicht nur ein technisch einfacher, gezielter Ansatz zur Identifizierung vielversprechender Lignocellulose-Biokatalysatoren ist, sondern es auch ermöglicht, die Analyse auf relevante, aktive Enzymunterfraktionen zu konzentrieren, z. B. solche, die an ein unlösliches Substrat gebunden sind.

Bisher hat unser ABPP-Ansatz mehrere potenzielle Lignocellulose abbauende Biokatalysatoren identifiziert. Ihre anschließende funktionale Annotation wurde durch Sequenzhomologieanalyse erreicht. Der ABPP-Ansatz kann jedoch prinzipiell auch die Identifizierung von Enzymen einer neuen Enzymfamilie ermöglichen, da die Enzymidentifizierung auf der ABP-Enzymreaktivität und nicht auf Sequenzhomologie basiert. Um zu zeigen, dass unser ABPP-Ansatz tatsächlich zur Identifizierung von Lignocellulose abbauenden Biokatalysatoren führte, wählten wir drei der ABPP-identifizierten Enzyme, Phchr2|126075, Phchr2|2915237 und Phchr2|3002168, für die weitere Expression und anschließende biochemische Charakterisierung aus (ergänzende Abbildung). . 2).

Die mutmaßliche Acetyl-Xylanesterase Phchr2|126075 (338 Aminosäuren; 35,5 kDa) wurde mit FP-Alkin im P. chrysosporium-Überstand (log2-fache Anreicherung von 7,18) und im SBF (log2-fache Anreicherung von 2,37) identifiziert. Phchr2|126075 gehört zur CE1-Familie und enthält ein pilzliches CBM1-Motiv für die Kohlenhydratbindung sowie ein Sekretionssignal. Die Esterasedomäne umfasst die Reste 80–288. Bemerkenswert ist, dass zuvor eine homologe Acetyl-Xylan-Esterase (Phchr2 | 129015, E-Wert 0,0, 89 % Sequenzidentität) aus derselben Spezies charakterisiert wurde56. Zur Charakterisierung wurde phchr2|126075 in den pKLAC2-Vektor kloniert und in Kluyveromyces lactis überexprimiert. Wie aus der Sequenzhomologie zu erwarten war, zeigte Phchr2|126075 Esteraseaktivität gegen pNP-Acetat und nachfolgende Tests zeigten die höchste Enzymaktivität bei einem pH-Wert von 8 bzw. 40 °C (ergänzende Abbildung 3). Weitere kinetische Charakterisierungen ergaben dann einen Vmax von 41,7 U mg-1 Protein und einen KM von 0,67 mM für die pNP-Acetat-Hydrolyse (Abb. 4a).

a Phchr2|126075 wurde heterolog in K. lactis produziert und die Aktivität gegen pNP-Acetat wurde bestätigt, indem die Freisetzung von pNP mit einem Vmax von 41,7 U mg−1 Protein und einem KM von 0,67 mM verfolgt wurde. b Substratspezifität von Phchr2|2915237 und WP_074995790 aus S. misionensis. Die Aktivität mit verschiedenen p-Nitrophenol-basierten Substraten wurde durch Messung der pNP-Freisetzung bestimmt. Die Aktivität gegenüber komplexen Polysacchariden wurde mithilfe des DNSA-Assays bestimmt, der die Bildung reduzierender Enden bei der Polysaccharidspaltung quantifiziert. Phchr2|2915237 zeigte die höchsten Aktivitäten mit pNP-Glc, pNP-Xyl, Lichenan und Buchenholz-Xylan, während WP_074995790, ein enges Homolog von Phchr2|3002168, nur Aktivität mit pNP-Gal als Substrat mit einer spezifischen Aktivität von 0,85 U zeigte mg−1 Protein. c Kinetische Charakterisierung von Phchr2|2915237 unter Verwendung von pNP-Glc, pNP-Xyl, Lichenan und Buchenholz-Xylan als Substrate. Alle Aktivitätsmessungen wurden dreifach durchgeführt (n = 3), Mittelwerte werden angezeigt und die Fehlerbalken geben die Standardabweichung (SD) an.

Phchr2|2915237 (422 Aminosäuren; 46,5 kDa) wurde identifiziert und mit JJB111 sowohl im löslichen Überstand (log2-fache Änderung: 10,71) als auch im SBF (log2-fache Änderung: 4,11) angereichert. Eine Analyse mit InterProScan weist auf das Vorhandensein einer GH5-Cellulasedomäne hin, die die Reste 67–330 umfasst. Phchr2|2915237 enthält ebenfalls ein extrazelluläres Sekretionssignal, aber keine Transmembrandomänen. Eine HHpred59-Analyse sagt entweder β-1-3-Glucanasen65 (E-Wert: 9,7e−35; 44 % Sequenzidentität) oder β-1-4-Xyloglucanasen66 (E-Wert: 8,8e−24, 18 % Sequenzidentität) voraus. als die nächsten Strukturhomologen. Darüber hinaus sind Homologe von Phchr2|2915237 in verschiedenen holzabbauenden Pilzarten vorhanden, wie z. B. Trametes oder Pleurotus, wie über BLASTP67 identifiziert. Das am nächsten charakterisierte Homolog (E-Wert: 9e−108, 45 % Sequenzidentität) von Phchr2|2915237 gehört zur Hefe Candida albicans und spielt eine Rolle im Zellwandstoffwechsel und der Zellwandumstrukturierung68.

Wir exprimierten Phchr2|2915237 heterolog in Aspergillus oryzae und untersuchten seine Substratspezifität unter Verwendung verschiedener chromogener p-Nitrophenol-Zucker-Konjugate sowie verschiedener Polysaccharide nach der Reinigung. Phchr2|2915237 zeigte eine hohe GH-Aktivität, wenn pNP-Glc und pNP-Xyl als Substrate verwendet wurden, während bei pNP-Ara nur Reste und bei pNP-Man, pNP-GlcNAc und pNP-Gal keine hydrolytische Aktivität beobachtet wurde (Abb. 4b). ). Für die pNP-Glc-Hydrolyse wurde ein pH- und Temperaturoptimum von 5 bzw. 60 ° C ermittelt (ergänzende Abbildung 3). Ein 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSA)-Assay ergab, dass Phchr2|2915237 auch in der Lage war, sowohl Lichenan als auch Buchenholz-Xylan abzubauen, während Carboxymethylcellulose (CMC), Galactomannan, Xyloglucan und Curdlan keine geeigneten Substrate waren (Abb. 4b). . Detailliertere kinetische Charakterisierungen ergaben einen Vmax von 999 U mg-1 Protein und einen KM von 1,82 mM sowie einen Vmax von 612 U mg-1 Protein und einen KM von 6,98 mM für pNP-Glucopyranosid bzw. pNP-Xylopyranosid. Für den Polysaccharidabbau wurde ein Vmax-Wert von 107 U mg-1 Protein mit einem KM-Wert von 5,5 mg mL-1 sowie ein Vmax-Wert von 71,6 U mg-1 Protein und ein KM-Wert von 13,8 mg mL-1 ermittelt Flechtenan bzw. Buchenholz-Xylan, was zeigt, dass Phchr2|2915237 auch natürliche, komplexere Zuckerpolymere spalten kann (Abb. 4c). Um festzustellen, ob Phchr2|2915237 als Exo- oder Endo-Glucanase/Xylanase fungiert, haben wir die von Phchr2|2915237 erzeugten Hydrolyseprodukte von Xylan und Lichenan mittels Dünnschichtchromatographie analysiert. Von den Glucanketten wurden keine Monosaccharide abgespalten; Stattdessen beobachteten wir die Bildung von Polysaccharid-Abbauprodukten mit unbekannter Länge (ergänzende Abbildung 4). Darüber hinaus zeigte ein gekoppelter Assay unter Verwendung einer Glucose- oder Xylose-Dehydrogenase auch keine Bildung von Glucose oder Xylose durch Phchr2|2915237 während der Hydrolyse von Lichenan bzw. Xylan.

Phchr2|3002168 (691 Aminosäuren; 74,4 kDa) ist ein uncharakterisiertes Protein, das mit JJB111 angereichert wurde; seine JJB111-Markierung wurde durch Vorbehandlung mit KY371 kompensiert. Das Vier-Domänen-Protein Phchr2|3002168 wird als Glutaminase bezeichnet, aber unser ABPP-Ansatz sowie unsere zuvor beschriebenen zusätzlichen Sequenzanalysen deuteten auf eine mögliche GH-Aktivität hin. Darüber hinaus ergab eine vollständige Proteomanalyse verschiedener Pilzarten, einschließlich P. chrysosporium, dass einige von ihnen Phchr2|3002168-homologe Proteine ​​in Gegenwart von Lignocellulose sezernierten69.

Wir haben daher versucht, dieses Protein mithilfe biochemischer Tests zu charakterisieren. Allerdings scheiterten alle unsere Versuche, Phchr2|3002168 in E. coli oder A. oryzae zu exprimieren und zu reinigen, was erneut die anhaltenden Schwierigkeiten eines Expressions- vs. ABPP-basierten funktionellen Biokatalysator-Screenings von Pilzproteinen unterstreicht. Um die Aktivität von Phchr2|3002168 als GH zu bestätigen, suchten wir daher nach nahen Homologen in anderen Organismen und fanden WP_074995790 aus Streptomyces misionensis (E-Wert: 0,0; 42 % Sequenzidentität) als vielversprechenden Kandidaten. Bitte beachten Sie, dass WP_074995790 zwar die gleiche Vier-Domänen-Struktur wie Phchr2|3002168 aufweist, in der InterPro-Proteinanmerkung jedoch nur die DUF5127-Domäne aufgeführt ist.

Wir haben daher WP_074995790 (752 Aminosäuren; 80,5 kDa) überexprimiert und obwohl dieses Enzym aufgrund der starken Aggregationstendenz in biochemischen Tests schwierig zu handhaben war, konnten wir mit diesem Präparat einige Enzymtests durchführen. Aufgrund seiner ursprünglichen Bestimmung als Glutaminase begannen wir mit entsprechenden Glutaminase-Enzymtests, konnten jedoch keine Umwandlung eines Glutaminsubstrats nachweisen. Als nächstes untersuchten wir die GH-Aktivität, indem wir denselben Satz pNP-basierter Zuckersubstrate testeten, der zuvor mit Phchr2|2915237 verwendet wurde. Zufriedenstellend konnten wir eine schwache β-Galactosidase-Aktivität mit einer spezifischen Gesamtaktivität von 0,85 U mg−1 Protein nachweisen. Alle anderen getesteten pNP-Substrate wurden jedoch nicht hydrolysiert (Abb. 4b). Insgesamt zeigten diese biochemischen Tests daher eine GH-Aktivität von WP_074995790, obwohl die beobachtete insgesamt schwache β-Galactosidase-Aktivität darauf schließen lässt, dass andere Kohlenhydratstrukturen, z. B. komplexere polymere Kohlenhydrate, bessere Substrate darstellen könnten.

Weißfäulepilze weisen hervorragende Zersetzungsfähigkeiten auf und sind für den Ligninabbau in pflanzlicher Biomasse verantwortlich; Sie haben daher großes Interesse als Ressourcen für die Identifizierung biotechnologisch relevanter Enzyme56,70 geweckt. Unter ihnen scheint die Art P. chrysosporium als Ausgangspunkt für die Entdeckung von Biokatalysatoren besonders gut geeignet zu sein, da ihre Enzyme aufgrund ihres recht hohen Wachstumstemperaturoptimums von 40 °C oft thermostabil sind71. Dementsprechend haben mehrere proteomische Studien sein Sekretom während des Wachstums auf Lignozellulosesubstraten untersucht, mit dem Ziel, Lignozellulose abbauende Biokatalysatoren zu identifizieren, obwohl die meisten der identifizierten Biokatalysatoren nie biochemisch validiert wurden46,55,69,72.

Hier haben wir einen alternativen Ansatz zur Identifizierung biotechnologisch relevanter Enzyme über ABPP mit Enzymklassen-spezifischen ABPs beschrieben, der es ermöglicht, die Analyse nur auf aktive Enzyme zu konzentrieren, die für den gesamten biologischen Prozess relevant sind. Dieser Ansatz kann zur schnellen Analyse extrazellulärer löslicher (Überstands-)Biokatalysatoren eingesetzt werden. Noch wichtiger ist jedoch, dass damit, wie hier erstmals beschrieben, auch substratgebundene Biokatalysatoren identifiziert werden können, in unserem Fall beispielsweise Enzyme, die an feste Lignozellulose in Form von Buchenholzspänen gebunden sind. Der ABPP-Ansatz stellt einen Vorauswahlschritt für die vielversprechendsten Biokatalysatoren dar. Seine Anwendung auf lösliche Enzyme oder Enzyme, die direkt an Substrate gebunden sind, ermöglicht dadurch ein technisch einfaches funktionelles Screening, von dem wir annehmen, dass es eine breitere Anwendung bei der gezielten Entdeckung von Biokatalysatoren finden könnte. Durch den Einsatz weiterer ABPs, z. B. GH-gerichteter Sonden mit unterschiedlicher α/β-Spezifität oder unterschiedlicher Zuckerselektivität50, können weitere Enzyme für den Lignocelluloseabbau aufgeklärt werden.

Um die Anwendbarkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, haben wir drei der identifizierten ABPP-„Treffer“ biochemisch validiert. Wir haben ein SH-Ziel des FP-Alkins sowie ein GH-Ziel des JJB111-ABPP-Markierungsansatzes ausgewählt. Darüber hinaus haben wir uns entschieden, ein bakterielles Homolog eines Zielenzyms, Phchr2|3002168, zu charakterisieren, das aufgrund von Sequenzanalysen nicht als kohlenhydrataktives Enzym (CAZyme) zugeordnet wurde. Das als FP-Alkin identifizierte Protein der CE1-Familie Phchr2|126075 war homolog zu einer charakterisierten Acetyl-Xylan-Esterase73 und wir konnten eine starke hydrolytische Aktivität gegen pNP-Acetat bestätigen. Dies deutet auf eine mögliche biotechnologische Anwendung dieses Enzyms in den ersten Schritten des Hemizelluloseabbaus hin, bei dem es sich um die Abspaltung von Acetylgruppen auf Lignozellulose handelt. Phchr2|2915237 wurde als promiskuitive und hochkatalytisch aktive Polysaccharid-spaltende β-Endoglucanase identifiziert, die Aktivität sowohl gegen Xylan und Lichenan als auch gegen pNP-Glc und pNP-Xyl zeigt und weder Glucose noch Xylose aus Lichenan- bzw. Xylanketten freisetzt . Es trägt daher höchstwahrscheinlich zum Abbau von Lignozellulose in P. chrysosporium bei. Phchr2|2915237 enthält ein Sekretionssignal für den extrazellulären Transport und gehört voraussichtlich zur GH5-Unterfamilie 9. Bisher sind nur wenige Enzyme aus dieser Unterfamilie bekannt, von denen die meisten exo-β-1,3- oder exo-β enthalten -1,4-Glucanase-Aktivität zusätzlich zu einer Endo-1,6-Glucanase-Aktivität bei einigen Familienmitgliedern. Insgesamt wurden 17 Familienmitglieder charakterisiert, die alle entweder zu verschiedenen Hefe- oder Aspergillus-Arten gehören, während bisher in keinem Basidiomyceten ein Homolog beschrieben wurde. Es wurde festgestellt, dass charakterisierte Homologe von Phchr2|2915237 eine Schlüsselrolle in morphogenetischen Prozessen während der Entwicklung und Differenzierung spielen, beispielsweise bei Candida albicans, wo Exo-β-1,3-Glucanasen Zellwandbereiche teilweise hydrolysieren und so die Insertion neuer Zellwände ermöglichen Material und kann zusätzlich auch 1,4- und 1,6-glykosidische Bindungen spalten68. In S. pombe war ein Protein der GH5-Unterfamilie 9 in der Lage, sowohl β-1,3- als auch β-1,6-glykosidische Bindungen zu hydrolysieren74,75. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass verschiedene Homologe als antimykotische Enzyme wirken oder am Abbau pflanzlicher Zellwände beteiligt sind76,77. Interessanterweise weist Phchr2|2915237 auch eine gewisse Ähnlichkeit mit Endo-1-4-Glucanasen auf, von denen gezeigt wurde, dass sie die Spaltung verschiedener Xylo-/Gluco-Oligosaccharide katalysieren66. Was die Spaltung von Pilzzellwänden in P. chrysosporium anbelangt, wurde bisher vor allem den Enzymen GH16 und GH55 zugeschrieben, dass sie an der Zellwandmorphogenese und dem Nährstoffrecycling beteiligt sind78. Obwohl wir die genauen In-vivo-Funktionen von Phchr2|2915237 nicht kennen, scheint sein Export induziert zu werden, wenn P. chrysosporium auf Lignozellulose gezüchtet wird, und seine duale Endo-Glucanase/Xylanase-Aktivität würde es dem Enzym ermöglichen, am Pflanzenabbau teilzunehmen Zellwandmaterial. Die insgesamt hohe enzymatische Aktivität und die breite Substratspezifität von Phchr2|2915237 in Verbindung mit seiner Kompatibilität mit der heterologen Expression in einem industriell relevanten Produktionsorganismus wie A. oryzae machen dieses Enzym zu einem vielversprechenden Biokatalysator für den effizienten Kohlenhydratabbau. Schließlich konnten wir das Potenzial von ABPP zeigen, auch Proteine ​​mit unbekannter oder falsch zugewiesener Funktion zu annotieren. Phchr2|3002168 wurde durch Markierung mit der GH-Sonde JJB111 identifiziert. Da es uns jedoch nicht gelang, dieses Protein direkt zu exprimieren, charakterisierten wir stattdessen das hochhomologe Protein WP_074995790 aus S. misionensis, einem Bakterium, von dem auch bekannt ist, dass es Cellulose in Form von Zuckerrohrbagasse abbaut79. Wir konnten eine β-Galactosidase-Aktivität bestätigen, obwohl die gesamte spezifische Aktivität niedrig war. Dies weist darauf hin, dass WP_074995790 möglicherweise tatsächlich GH-Aktivität besitzt, wir jedoch bisher nicht in der Lage waren, die nativen Substrate für diese neuen Enzyme zu identifizieren. Basierend auf unserem Markierungsansatz, der Sequenzanalyse und den Enzymtests schlagen wir jedoch vor, dass Proteine, die DUF4964-, DUF5127-, DUF4965- und DUF1793-Domänen enthalten, wie z. B. Phchr2|3002168 oder WP_074995790, als Glykosidhydrolasen fungieren könnten.

Es ist jedoch zu beachten, dass der in dieser Studie beschriebene ABPP-Ansatz auch einige Einschränkungen aufweist. Die Identifizierung potenzieller ABPP-Zielproteine ​​wird von den Zellkultivierungsbedingungen beeinflusst, da die Zusammensetzung der von P. chrysosporium sezernierten Proteine ​​von der Kulturwachstumszeit sowie der Quelle und Behandlung der lignozellulosehaltigen Biomasse abhängt. Da beide Faktoren in dieser Studie festgelegt wurden, ist der Umfang potenzieller Ziele auf die Proteine ​​beschränkt, die unter diesen Bedingungen produziert und sezerniert werden. Darüber hinaus kann die Verwendung zusätzlicher ABPs, vorzugsweise mit unterschiedlicher Zielspezifität, die Identifizierung weiterer Enzyme ermöglichen. Die ABPP-Markierung kann auch durch die Anwesenheit oder enzymvermittelte Produktion konkurrierender Metaboliten verringert werden. Schließlich erfordern die meisten ABBP-Methoden derzeit aufgrund eines geringen Anteils an unspezifischer Markierung während der ABPP-Profilierung eine anschließende bioinformatische Analyse und die Überprüfung von Zieltreffern durch Expression und Reinigung.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser ABPP-Ansatz dazu beitragen kann, eine anhaltende Herausforderung bei der Entdeckung von Biokatalysatoren zu bewältigen: die Schwierigkeit, Daten aus einem Funktionsscreening mit Sequenzinformationen zu verknüpfen. Der ABPP-Ansatz verkürzt dies und ermöglicht die Eingrenzung der Analyse auf aktive Enzyme, auf die die enzymselektive ABP-Sonde abzielt. Da immer mehr ABPs verfügbar werden, könnte dies die Identifizierung von Biokatalysator-Ensembles sogar für den Abbau komplexer Substrate ermöglichen, indem nur identifizierte Enzyme aus verschiedenen ABPP-Screening-Kampagnen zusammengefügt werden.

Chemikalien für die Kultivierung von Escherichia coli und P. chrysosporium DSM 1556, einschließlich Hefeextrakt, Malzextrakt, Sojaton, Lysogenie-Brühe, TRIS, MES und Salze für Minimalmedien, wurden von Carl Roth (Deutschland) bezogen. Buchenhackschnitzel für das Wachstum wurden von der J. Rettenmaier Söhne GmbH & Co. KG bezogen. (Deutschland). Carboxymethylcellulose (CMC), Lichenan, Mannan, Xyloglucan und Glucomannan wurden von Sigma Aldrich (USA) bezogen, und Buchenholz-Xylan wurde von Carl Roth (Deutschland) bezogen. para-Nitrophenol (pNP), para-Nitrophenyl-β-d-galactopyranosid (pNP-Gal), para-Nitrophenylacetat (pNP-acetat), para-Nitrophenyl-β-d-glucopyranosid (pNP-Glc), para- Nitrophenyl-β-d-xylopyranosid (pNP-Xyl), para-Nitrophenyl-β-d-mannose (pNP-Man), para-Nitrophenyl-β-d-arabinofuranosid (pNP-Ara) und para-Nitrophenyl-N- Acetyl-β-d-glucosamin (pNP-GlcNAc) wurde von Megazyme (Irland) bezogen, n-Dodecyl-β-d-maltosid (DDM) wurde von Thermo Scientific (USA) und Rinderserumalbumin (BSA) von VWR Chemicals bezogen ( USA). Die Bezugsquellen methodenspezifischerer Reagenzien werden im entsprechenden Verfahrensabschnitt angegeben.

P. chrysosporium DSM 1556 wurde von der DSMZ (Deutschland) bezogen. Zur Langzeitlagerung wurde P. chrysosporium DSM 1556 2 Tage lang bei 37 °C auf MYP-Agarplatten (6 g L-1 Malzextrakt, 1 g L-1 Pepton aus Soja, 0,5 g L-1 Hefeextrakt) gezüchtet . Anschließend wurden die Zellen abgekratzt, in 100-µL-Aliquots sterilem 50 % (v/v) Glycerin resuspendiert und bei –80 °C als Glycerinstamm gelagert. Für das Wachstum fester Kulturen wurde 1,5 % (w/v) MYP-Agar mit 20 µL P. chrysosporium DSM 1556-Glycerol-Stamm beimpft und 2 Tage lang bei 37 °C wachsen gelassen, bis die gesamte Agarplatte mit Pilzhyphen bedeckt war. Anschließend Minimalmedium mit 2,5 g L−1 K2HPO4, 0,02 g L−1 KH2PO4, 0,1 g L−1 NaCl, 0,02 g L−1 CaCl2, 0,1 g L−1 (NH4)2SO4, 0,02 g L−1 MgSO4, 0,001 g L−1 FeSO4 und 40 g L−1 Buchenholzspäne bei pH 5, ergänzt mit 100 µg mL−1 Chloramphenicol zur Hemmung des Bakterienwachstums, wurden mit auf Platten gewachsenem P. chrysosporium DSM 1556 inokuliert. Suspensionskulturen wurden 5 Tage lang bei inkubiert 37 °C unter ständigem Schütteln (180 U/min). Das Zellwachstum wurde durch Verfolgung der Bildung von Pilzhyphen sowie durch den makroskopischen Abbau des Wachstumssubstrats verfolgt. E. coli Rosetta DE3 wurde entweder in Standard-LB-Medium (10 g L-1 Trypton, 10 g L-1 NaCl, 5 g L-1 Hefeextrakt) in Vorkulturen oder in TB-Medium (22 g L-1 Hefe) gezüchtet Extrakt, 12 g L-1 Trypton, 4 ml L-1 Glycerin, 0,072 M K2HPO4, 0,017 M KH2PO4, pH 7,2) zur heterologen Überexpression von Enzymen. Kluyveromyces lactis GG799 wurde in den mitgelieferten Medien des NEB K. lactis-Proteinexpressionskits (New England Biolabs, USA) oder in YPGlu-Medien (10 g L−1 Hefeextrakt, 20 g L−1 Pepton, 2 % Glucose, pH 7) gezüchtet ) für heterologe Überexpression.

Nach 5 Tagen wurde der Überstand entfernt und durch Filtration durch einen 0,2-µm-Filter (Filtropur S 0,2; Sarstedt, Deutschland) sterilisiert. Um MS-Proben zu erhalten, wurden 50 ml (Markierungs-)Kulturüberstand eingefroren, über Nacht lyophilisiert und anschließend bis zur weiteren Analyse bei –20 °C gelagert. Zur Isolierung substratgebundener Proteine ​​wurde P. chrysosporium DSM 1556 auf 40 g L−1 Buchenholzspänen in einem Minimalmedium in 50 ml submerser Kultur pro Replikat für insgesamt drei bzw. vier biologische Replikate gezüchtet. Nach einer Wachstumszeit von 5 Tagen wurden die Buchenholzspäne durch Dekantieren vom Kulturmedium und den freien Pilzzellen getrennt und die verbleibenden Holzspäne dreimal mit 50 ml Puffer (50 mM TRIS, pH 8) durch Zentrifugation (3000°C) gewaschen × g, 10 min, 4 °C), um alle ungebundenen Proteine ​​und Zellen zu entfernen. Die pelletierten Holzspäne wurden dann in 5 ml 50 mM TRIS pH 8, das 0,1 % (w/v) des MS-kompatiblen Detergens DDM enthielt, 30 Minuten lang bei 37 °C unter konstantem Schütteln mit 180 U/min inkubiert, um alle substratgebundenen Substanzen zu lösen Proteine. Ähnlich wie der Überstand wurden 5 ml der Ablösungslösung eingefroren, über Nacht lyophilisiert und anschließend bis zur weiteren Analyse bei –20 °C gelagert.

Alle Sonden und Konkurrenten wurden in DMSO gelöst. Um Enzymziele von FP-Alkin und JJB111 zu identifizieren, wurden lyophilisierte Proteine ​​in 2 ml (Überstand) oder 100 µL (SBF) von entweder 50 mM Na2PO4 (pH 8,0) (FP-Alkin-Markierung) oder 50 mM NaOAc (pH 5,0) resuspendiert. (JJB111-Markierung) und die Proteinkonzentration wurde mit Roti®-Nanoquant (modifizierter Bradford-Assay; Carl Roth, Deutschland) bestimmt. Eine Gesamtmenge von 400 µg (Überstand) bzw. 100 µg (substratgebundene Fraktionen) Protein wurde mit 2 µM der angegebenen Sonde markiert (1 h, 37 °C, kräftiges Schütteln). Für die Konkurrenz der Markierung mit den angegebenen ABPs wurden wie angegeben entweder 50 µM Paraoxon (FP-Alkin-Markierung) oder 20 µM KY358-Acyl oder KY371 (JJB111-Markierung) verwendet (30 min, 37 °C, kräftiges Schütteln). FP-Alkin-markierte Proteine ​​wurden anschließend einer Klickreaktion mit 10 µM TAMRA-Biotin-N3 (Jena Bioscience, Deutschland), 100 µM TBTA (Sigma Aldrich, USA), 2 mM TCEP (Sigma Aldrich, USA) und 1 mM unterzogen CuSO4 (Sigma Aldrich, USA; 1 h, Raumtemperatur, im Dunkeln).

Vor der Affinitätsanreicherung wurde eine modifizierte Methanol-Chloroform80-Fällung durchgeführt, um Proteine ​​zu reinigen. Kurz gesagt, Proteinlösungen wurden mit vier Äquivalenten Methanol (–20 °C, über Nacht) inkubiert, bevor ein Äquivalent Chloroform und drei Äquivalente Wasser in MS-Qualität (VWR Chemicals, USA) hinzugefügt wurden. Die ausgefällten Proteine ​​wurden zweimal mit Methanol gewaschen, an der Luft getrocknet und dann in einem Endvolumen von 8 ml 0,2 % (w/v) SDS in 1× PBS (155 mM NaCl, 3 mM Na2HPO4, 1,06 mM KH2PO4, pH 7,4) gelöst ) unter leichtem Schütteln (37 °C, 30 min). Zur Anreicherung von ABP-reagierten Proteinen wurde die erhaltene Proteinlösung mit 100 µL Avidin-Perlenaufschlämmung (Thermo Scientific, USA) unter leichtem Rotieren inkubiert (1 Stunde, Raumtemperatur). Anschließend wurden die Perlen fünfmal mit 0,2 % (Gew./Vol.) SDS gewaschen (10 Min., Raumtemperatur, leicht rotierend), gefolgt von drei Waschgängen mit H2O in MS-Qualität (5 Min., Raumtemperatur, kräftiges Schütteln) und gesammelt durch Zentrifugation (400 × g, Raumtemperatur, 5 min). Die gewaschenen Perlen wurden in 100 µL 0,8 M Harnstoff (GE Healthcare Life Sciences, USA) in 50 mM Ammoniumbicarbonat (ABC) aufgenommen, die Proteine ​​wurden mit 5 mM Dithiothreitol (DTT, Sigma Aldrich, USA) in 50 mM ABC reduziert (30 min, 37 °C, kräftiges Schütteln) und anschließend durch Zugabe von 10 mM Iodacetamid (IAM) in 50 mM ABC (30 min, 37 °C, im Dunkeln) alkyliert. Die Alkylierungsreaktion wurde durch Zugabe von DTT bis zu einer Endkonzentration von 10 mM gestoppt. Zur Proteinverdauung wurde 1 µg Trypsin (Thermo Fisher Scientific, USA) in 50 mM Essigsäure zugegeben (37 °C, 16 h, kräftiges Schütteln). Die Perlen wurden durch Zentrifugation (5 Min., Raumtemperatur, 650 × g) gesammelt und der Überstand wurde gewonnen und mit Ameisensäure (FA) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % (v/v) gemischt. Um die Perlen zu waschen, wurden 40 µL 1 % (v/v) FA zugegeben (5 Min., Raumtemperatur, kräftiges Schütteln) und der Überstand wurde mit der gewonnenen Verdauungsmischung kombiniert. Um die restlichen Perlen aus der Peptidlösung zu entfernen, wurde die Mischung durch eine selbstgemachte Zweischeiben-Glasmikrofasermembran (GE Healthcare, USA; Porengröße 1,2 µm, Dicke 0,26 mm) StageTip zentrifugiert (5 Min., Raumtemperatur, 100 x g). . Die geklärte Peptidlösung wurde dann wie beschrieben auf selbstgemachten C18 StageTips entsalzt (für das verwendete Protokoll siehe unten).

Alle Peptidlösungen wurden nach dem Aufschluss und der Entfernung von Feststoffen mit selbstgemachten C18 StageTips wie zuvor beschrieben81 entsalzt. Alle Zentrifugationsschritte wurden im Bereich von 400–800 × g und für 1–3 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Kurz gesagt, die angesäuerten tryptischen Verdaus wurden über StageTips mit zwei Scheiben geleitet und die immobilisierten Peptide wurden zweimal mit 0,5 % (v/v) FA gewaschen. Die Peptide wurden von den StageTips durch eine zweistufige Elution mit 80 % (v/v) Acetonitril mit 0,5 % (v/v) FA eluiert. Nach der Elution aus den StageTips wurden die Proben mit einem Vakuumkonzentrator (Eppendorf, Deutschland) getrocknet und die Peptide in 15 µL 0,1 % (v/v) FA resuspendiert. Die so vorbereiteten Proben wurden direkt für LC-MS/MS-Experimente verwendet (Einzelheiten siehe unten).

LC-MS/MS-Experimente wurden mit einem Orbitrap Fusion Lumos-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, USA) durchgeführt, das an ein EASY-nLC 1200-Flüssigkeitschromatographiesystem (LC) (Thermo Fisher Scientific, USA) gekoppelt war. Der LC wurde im Einsäulenmodus betrieben und die analytische Säule war eine Quarzglaskapillare (Innendurchmesser 75 μm × 36–46 cm) mit integriertem PicoFrit-Emitter (New Objective, USA), hausintern gepackt mit Reprosil-Pur 120 C18-AQ 1,9 μm (Dr. Maisch, Deutschland). Die analytische Säule war von einem Säulenofen (Sonation, Deutschland) umgeben und an eine Nanospray-Flex-Ionenquelle (Thermo Fisher Scientific, USA) angeschlossen. Die Temperatur des Säulenofens wurde während der Datenerfassung auf 50 °C eingestellt. Der LC war mit zwei mobilen Phasen ausgestattet: Lösungsmittel A (0,1 % (v/v) FA, in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1 % (v/v) FA, 20 % (v/v) H2O, in Acetonitril). Alle Lösungsmittel waren von UHPLC-Qualität (Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie) (Honeywell, Deutschland). Peptide wurden direkt auf die analytische Säule mit einer maximalen Flussrate geladen, die den eingestellten Druckgrenzwert von 980 bar (normalerweise etwa 0,5–0,8 µL min−1) nicht überschreiten würde. Anschließend wurden Peptidlösungen auf der analytischen Säule mit unterschiedlichen Gradienten (105 min Länge; Einzelheiten siehe Ergänzungsdatei Sample_Legend_and_LC-MS_Settings, Abschnitt „LC_Settings“) getrennt.

Das Massenspektrometer wurde mit der Xcalibur-Software v4.3.7.3.11 betrieben. Das Massenspektrometer wurde auf den positiven Ionenmodus eingestellt. Das Vorläufer-Ionen-Scanning (MS1) wurde im Orbitrap-Analysator (FTMS; Fourier-Transformations-Massenspektrometrie) mit aktivierter Option für die interne Sperrmasse durchgeführt (die Sperrmasse betrug 445,120025 m/z, Polysiloxan))82. Der dynamische Ausschluss wurde aktiviert (Ausschluss nach n-mal = 1; Ausschlussdauer (s) = 120; Massentoleranz = ±10 ppm). MS2-Produktions-Ionenspektren wurden nur von Ionen mit einer Ladung größer als +1 und datenabhängig im ITMS (Ion Trap Mass Spectrometry) aufgezeichnet. Alle relevanten, individuellen MS-Einstellungen (Auflösung, Scanrate, Scanbereich, AGC, Ionenerfassungszeit, Ladungszustände, Isolationsfenster, Fragmentierungstyp und -details, Zykluszeit, Anzahl der durchgeführten Scans und verschiedene andere Einstellungen) für die einzelnen Experimente können finden Sie in der Zusatzdatei Sample_Legend_and_LC-MS_Settings, Abschnitt „MS_Settings“).

RAW-Spektren wurden mit den Standardeinstellungen einer Andromeda-Suche in MaxQuant83 (Version 1.6.10.43) unterzogen. Markierungsfreie Quantifizierung und Übereinstimmung zwischen Läufen wurde aktiviert. MS/MS-Spektrendaten wurden anhand der Datenbanken UniProt P. chrysosporium (Phanerochaete_chrysosporium_Uniprot_210114.fasta; 430 Einträge) und Joint Genome Institute P. chrysosporium (Phanerochaete_chrysosporium_JGI_210114.fasta)42 (am besten gefiltertes Modell, 13602 Einträge) durchsucht. Alle Suchvorgänge umfassten eine Schadstoffdatenbank (wie in MaxQuant implementiert, 246 Sequenzen). Die Kontaminantendatenbank enthält bekannte MS-Kontaminanten und wurde einbezogen, um den Grad der Kontamination abzuschätzen. Andromeda-Suchen ermöglichten die Oxidation von Methioninresten (16 Da), die Acetylierung des N-Terminus des Proteins (42 Da) als dynamische Modifikationen und die statische Modifikation von Cystein (57 Da, Alkylierung mit IAM). Die Enzymspezifität wurde auf „Trypsin/P“ eingestellt. Der Instrumententyp bei Andromeda-Suchen wurde auf Orbitrap und die Vorläufer-Massentoleranz auf ±20 ppm (erste Suche) und ±4,5 ppm (Hauptsuche) eingestellt. Die MS/MS-Übereinstimmungstoleranz wurde auf ±0,5 Da eingestellt. Das Peptidspektrum stimmte mit FDR überein und das Protein-FDR wurde auf 0,01 eingestellt (basierend auf dem Target-Decoy-Ansatz). Die minimale Peptidlänge betrug sieben Aminosäuren. Zur Proteinquantifizierung waren Unique- und Razor-Peptide zugelassen. Zur Quantifizierung wurden modifizierte Peptide mit dynamischen Modifikationen zugelassen. Die Mindestpunktzahl für modifizierte Peptide betrug 40. Die Übereinstimmung zwischen Läufen wurde mit einem Übereinstimmungszeitfenster von 0,7 Minuten und einem Übereinstimmungs-Ionenmobilitätsfenster von 0,05 Minuten ermöglicht84. Eine weitere Datenanalyse und Filterung der MaxQuant-Ausgabe erfolgte in Perseus v1.6.2.3.85. Intensitäten der markierungsfreien Quantifizierung (LFQ) wurden aus der Datei proteinGroups.txt und potenziellen Kontaminanten sowie Treffern aus der Reverse-Datenbank in die Matrix geladen Treffer, die nur durch Peptide mit einer Modifikationsstelle identifiziert wurden, wurden entfernt. Verwandte biologische Replikate wurden in kategoriale Gruppen zusammengefasst, um einen Vergleich verschiedener Behandlungen oder Kulturmedien zu ermöglichen. Die Daten wurden auf die log2-Skala transformiert und nur die Proteine, die in zwei von drei bzw. drei von vier Replikaten gefunden wurden, wurden separat untersucht. Vor der Quantifizierung wurden fehlende Werte aus einer Normalverteilung (Breite 0,3, Herunterverschiebung 1,8) errechnet.

In Markierungsexperimenten wurde die log2-fache Anreicherung von Proteingruppen durch FP-Alkin oder JJB111 auf der Grundlage eines zweiseitigen Student-t-Tests (permutationsbasierter FDR: 0,05, s = 0,1, 250 Randomisierungen) im Vergleich zur DMSO-Kontrolle berechnet . Proteine ​​mit einer log2-fachen Änderung >2 wurden als signifikant angereichert betrachtet und alle Proteine ​​mit einer positiven fachen Änderung wurden gegen ihre numerische Reihenfolge aufgetragen. Um die Auswirkung der Konkurrenz-Vorbehandlung auf die Proteinanreicherung zu untersuchen, wurde ein zweiseitiger Student-t-Test (permutationsbasierter FDR: 0,05, s = 0,1, 250 Randomisierungen) durchgeführt, um den Unterschied in der Proteinhäufigkeit zwischen nicht-kompetitiven und vorbehandelten Sonden zu berechnen. markierte Proben und die statistische Signifikanz der Faltungsänderung. Die log2-fache Änderung für Proben, die mit den entsprechenden Konkurrenten vorinkubiert wurden, im Vergleich zu Nicht-Kompetitionsproben, die mit der jeweiligen Sonde markiert waren, wurde gegen den –log p-Wert aufgetragen. Proteine ​​mit einer Verringerung ihrer Häufigkeit um > 75 % und einem ap-Wert < 0,01 wurden als primäre Treffer betrachtet, während Proteine ​​mit einem ap-Wert < 0,05 als sekundäre Treffer gemeldet wurden. Die Protein-ID wurde entweder als JGI-ID oder Uniprot-ID angegeben.

Für die Synthese von cDNA aus P. chrysosporium DSM 1556 wurden Suspensionskulturen auf einem Minimalmedium mit Buchenholzspänen für 5 Tage gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen durch Dekantieren von den Buchenholzspänen getrennt und durch Zentrifugation (6000 × g, 4 °C, 30 min) gesammelt und in 5 ml Puffer (10 mM TRIS, pH 8) resuspendiert. Etwa 500 µl Zellen wurden dann in ein 0,1/0,5-mm-Bashing-Beads-Fläschchen (Zymo Research, USA) überführt und in einem Bead-Beater (Precellys 24, VWR, USA) lysiert. Anschließend wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation (16.000 × g, 2 Min.) entfernt und RNA aus 300 µL lysierter Zellen unter Verwendung des Monarch Total RNA Isolation Kit (New England Biolabs, USA) durch Mischen mit 300 µL RNA-Lysepuffer isoliert . Nach der RNA-Isolierung wurde eine cDNA-Bibliothek von P. chrysosporium DSM 1556 unter Verwendung des SMARTer PCR cDNA-Synthesekits (Takara Bio Europe, Frankreich) synthetisiert. Die cDNA wurde bei –20 °C gelagert und zur Amplifikation und Sequenzierung der Zielgene verwendet. Das P. chrysosporium-Gen phchr2|126075 wurde ohne Introns aus cDNA unter Verwendung von Q5®-Polymerase (New England Biolabs, USA) und den folgenden genspezifischen Primern (Eurofins Genomics, Deutschland) 5′-ATGAGGTTGACATGTCCC-3′ und 5′-ACCTCCAATTCCTCGG amplifiziert -3'. Das resultierende PCR-Produkt wurde dann als Matrize für die Amplifikation von phchr2|126075 verwendet, das zusätzliche spezifische Restriktionsstellen für den pKLAC2-Vektor enthielt, unter Verwendung der folgenden Primer: 5′-GAGGAGCATATGATGAGGTTGACATGTCCC-3′ und 5′-GAGGAGCTCGAGACCTCCAATTCCTCGG-3′ (NdeI und XhoI). Restriktionsstellen unterstrichen). Anschließend wurden die PCR-Produkte mit dem Wizard® SV Gel und dem PCR-Reinigungskit (Promega, USA) gereinigt. Phchr2|126075 wurde nach Restriktionsverdau der gereinigten PCR-Produkte und des leeren Vektors mit den jeweiligen Restriktionsenzymen (NEB, USA) in den pKLac2-Vektor (Novagen, USA) kloniert. Das eingeschränkte PCR-Produkt und der Vektor wurden in einem Molverhältnis von 1:4 für die Ligation unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, USA) bei 16 °C über Nacht verwendet. E. coli DH5α-Zellen (Novagene, USA) wurden mit den erhaltenen Konstrukten transformiert und das Vorhandensein erfolgreich klonierter Gene wurde durch Sequenzierung unter Verwendung der oben genannten genspezifischen Primer bestätigt. pKLAC2:phchr2|126075 wurde dann gemäß den Anweisungen des Herstellers (New England Biolabs, USA) in K. lactis GG799 transformiert. Die korrekte Integration von phchr2|126075 wurde durch PCR unter Verwendung der mitgelieferten Integrationsprimer bestätigt. Transformierte Klone wurden in 2 ml YPGlu-Medium inokuliert, um die Sekretion von Phchr2|126075 zu testen. Expressionsklone wurden isoliert und in 250 µl sterilem 20 % (v/v) Glycerin resuspendiert und zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Für die Expression von phchr2|3002168 aus P. chrysosporium und WP_074995790 aus Streptomyces misionensis in E. coli Rosetta DE3 wurden die kodierenden Sequenzen beider Gene von BioCat (Deutschland) ohne Sekretionssignale für die Klonierung in den pET20b-Vektor (mit C-Terminus) synthetisiert His-Tag). Zur heterologen Überexpression wurde E. coli Rosetta DE3 frisch mit dem entsprechenden Plasmid transformiert.

Die rekombinante Produktion von Phchr2|126075 wurde in K. lactis GG799 (New England Biolabs, USA) durchgeführt. Nach der Transformation wurde der Kulturüberstand durch Zentrifugation (4000 × g, 30 min, 4 °C) gesammelt und auf den Klon mit der höchsten Aktivität gegen pNP-Acetat (50 ml Kulturvolumen) gescreent. Dazu wurden 100 µL des Überstandes mit 100 µL 50 mM TRIS pH 8 und 400 µM pNP-Acetat inkubiert und die Freisetzung von p-NP bei 410 nm in einer 96-Well-Platte (BRANDplates®, BRAND , Deutschland) mit einem Tecan-Infinite-M200-Plattenlesegerät (Tecan Trading AG, Schweiz). Zur Proteinexpression wurden 50 ml Kultur mit 1 % (v/v) einer Vorkultur beimpft und 3 Tage lang bei 30 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert (4000 × g, 30 min, 4 °C) und der Überstand durch einen 0,45 µm-Filter (Rotilabo® Spritzenfilter, Carl Roth, Deutschland) geleitet, bevor er zur Bestimmung der Esteraseaktivität von Phchr2|126075 verwendet wurde .

Für die Herstellung von WP_074995790 wurde eine frisch inokulierte E. coli Rosetta DE3 [pET20b::WP_074995790]-Kultur in Terrific Broth (TB)-Medium (500 ml), ergänzt mit 150 µg mL−1 Ampicillin und 50 µg mL−1 Chloramphenicol, verwendet bei 37 °C unter ständigem Schütteln (180 U/min) auf eine OD600 von 0,8 gezüchtet. Die Proteinexpression wurde durch die Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Die Zellen wurden dann weitere 16 Stunden bei 18 °C inkubiert, durch Zentrifugation (6000 × g, 20 min, 4 °C) gesammelt und in 10 ml Puffer A (50 mM TRIS-HCl pH 7,8, 200 mM KCl) resuspendiert , 10 mM Imidazol) pro Gramm Nassgewicht. Die Zelllyse wurde durch Ultraschallbehandlung mit einem Ultraschallgerät UP 200 S (Hielscher Ultraschall GmbH, Deutschland) für 3 × 7 Minuten (50 % Amplitude, 0,5 s−1) unter konstanter Kühlung und anschließende Zentrifugation (14.000 × g, 60 Minuten, 4 °C) durchgeführt C). Zur weiteren Reinigung von WP_074995790 wurde das geklärte Lysat durch einen 0,45-µm-Filter (Rotilabo®-Spritzenfilter, Carl Roth, Deutschland) geleitet und auf eine mit Puffer A äquilibrierte 5-ml-Ni-IDA-Säule (Cytiva, USA) bei einer Fließgeschwindigkeit aufgetragen von 5 ml min−1. Nach dem Waschen mit Puffer A (20 Säulenvolumina) wurde die Elution mit einem linearen Gradienten von Puffer B (50 mM TRIS pH 7,8, 200 mM KCl, 400 mM Imidazol) durchgeführt. Der Elutionspuffer wurde gegen Lagerungspuffer (50 mM TRIS pH 8,0, 20 mM KCl, 10 % (v/v) Glycerin) unter Verwendung von Amicon® Zentrifugalfiltergeräten (50 kDa Cutoff, Merck, Deutschland) durch wiederholtes Konzentrieren und Verdünnen ausgetauscht. Zur Lagerung wurden die Proteine ​​in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

Ein synthetisches Gen, das für Phchr2|2915237 kodiert, wurde als gBlock bei IDTdna (USA) bestellt, in das Genom von Aspergillus oryzae integriert und wie an anderer Stelle beschrieben als extrazelluläres Enzym exprimiert86. Ein C-terminaler His-Tag (6xHis) wurde hinzugefügt, um die nachgeschaltete Reinigung zu erleichtern. Die Fermentationsbrühe wurde steril filtriert und mit 500 mM NaCl versetzt und durch Zugabe von NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Die Probe wurde auf eine Ni-Sepharose™ 6 Fast Flow-Säule (GE Healthcare, USA) geladen, die in 50 mM HEPES, pH 7,5, mit 500 mM NaCl (Puffer A) äquilibriert war. Nach dem Beladen wurde die Säule mit 10 Säulenvolumina Puffer A gewaschen und gebundene Proteine ​​wurden mit 500 mM Imidazol in Puffer A eluiert. Die das Enzym enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und auf ein Sephadex™ G-25 (Medium) (GE Healthcare) aufgetragen , USA) Säule äquilibriert und in 100 mM HEPES pH 7,5 eluiert. Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert und die das Enzym enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert.

Die Esteraseaktivität wurde durch Messung der Freisetzung von pNP aus pNP-Acetat bei 410 nm in einem diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Test bestätigt. Um das pH-Optimum von Phchr2|126075 zu bestätigen, wurden 1,08 µg Protein in 50 mM Phosphatcitratpuffer bei einem pH-Bereich von 5,5 bis 8 mit 25 mM pNP-Acetat in einem Gesamtvolumen von 500 µL für 10 Minuten bei 35 °C inkubiert . Anschließend wurden die Reaktionen durch Zugabe von 500 µL 0,5 M Natriumcarbonat gestoppt und die Absorption der Proben bei 410 nm bestimmt. Die Produktion von pNP wurde dann anhand des ermittelten Extinktionskoeffizienten von 16,1 mM−1 cm−1 für pNP87 berechnet. Zur Bestimmung des Temperaturoptimums wurde Phchr2|126075 in 50 mM TRIS pH 8, 20 mM KCl inkubiert und die Freisetzung von pNP aus pNP-Acetat kontinuierlich in einem Temperaturbereich von 30 bis 70 °C in einem Gesamtvolumen von 500 µL bestimmt . Zur Bestimmung der kinetischen Konstanten wurde Phchr2|126075 mit unterschiedlichen Konzentrationen von pNP-Acetat bei 40 °C in einer wässrigen Lösung mit 50 mM TRIS pH 8 und 20 mM KCl inkubiert. Die Anfangsgeschwindigkeiten jeder Reaktion wurden gemessen und zur Berechnung der Aktivitäten verwendet. Alle Enzymtests wurden dreifach durchgeführt.

Die Aktivität von Phchr2|2915237 und WP_074995790 wurde gegen verschiedene Polysaccharide und künstliche pNP-Konjugate nachgewiesen. Der pH-Wert und das Temperaturoptimum von Phchr2|2915237 wurden durch 10-minütige Inkubation von 0,5 µg eines Enzyms mit 200 µM pNP-Glc oder pNP-Gal in 500 µL Phosphatcitratpuffer88 bei einem pH-Bereich von 3–8 bei 30 °C bestimmt bzw. ein Temperaturbereich von 30–70 °C bei pH 5. Nach der Inkubation wurden die Reaktionen durch Zugabe von 500 µL 0,5 M Natriumcarbonat gestoppt und die Spaltung von pNP-Glc durch Bestimmung der Freisetzung von pNP bei 410 nm wie oben beschrieben verfolgt. Zur Messung der Substratspezifität von Phchr2|2915237 und WP_074995790 gegenüber pNP-Konjugaten wurden entweder 200 µM pNP-Ara, pNP-GlcNAc, pNP-Gal und pNP-Man mit 10 µg Phchr2|2915237 oder 11,2 µg WP_074995790 inkubiert oder 200 µM pNP-Xyl und pNP-Glc wurden mit 0,4 µg Phchr2|2915237 oder 11,2 µg WP_074995790 wie oben beschrieben inkubiert. Kinetische Messungen gegen Nitrophenylsubstrate wurden in einem diskontinuierlichen Assay durchgeführt, indem unterschiedliche Konzentrationen von pNP-Glc und pNP-Xyl mit 0,5 µg Phchr2|2915237 inkubiert und die Reaktion nach 1, 2, 5 bzw. 10 Minuten gestoppt wurde. Anschließend wurden die Anfangsgeschwindigkeiten der Reaktion verwendet, um die spezifische Aktivität von Phchr2|2915237 gegenüber Nitrophenolsubstraten zu berechnen.

Zur Messung der Substratspezifität von Phchr2|2915237 gegenüber Xyloglucan, Galactomannan, Curdlan, CMC, Xylan und Lichenan wurde 1 µg Enzym mit 0,5 % (w/v) der jeweiligen Polysaccharide in 500 µL Zitronensäure-Phosphatpuffer inkubiert pH 5 für 1, 2, 5 und 10 Minuten. Anschließend wurden 500 µL der DNSA-Lösung (10 g L-1 DNSA, 2 ml L-1 0,05 g L-1 Natriumsulfit, 200 g L-1 Kaliumnatriumtartrat und 10 g L-1 NaOH) hinzugefügt und anschließend 15 min bei 100 °C inkubiert. Die Proben wurden dann 15 Minuten lang auf Eis gekühlt und zentrifugiert (10.000 × g, 4 °C 30 Minuten lang), bevor 250 µL des Überstands in eine 96-Well-Platte (BRANDplates®, BRAND, Deutschland) überführt wurden. Die Freisetzung reduzierender Zucker wurde bei 575 nm mit einem Tecan-Infinite-M200-Plattenlesegerät (Tecan Trading AG, Schweiz) verfolgt und mithilfe einer auf D-Glucose basierenden Kalibrierungskurve bestimmt. Die Hintergrundabsorption aufgrund des abiotischen Substratabbaus und der Zugabe von Proteinlösungen wurde bestimmt und von der Absorption der Proben abgezogen. Die Glutaminaseaktivität wurde unter Verwendung von L-Gamma-Glutamyl-pNP wie zuvor beschrieben89 oder durch Überwachung der Bildung von Glutamat aus Glutamin durch Glutamatdehydrogenase (Merck, Deutschland) über die Reduktion von NAD+ getestet. Um die Bildung von Glucose oder Xylose während des Polysaccharidabbaus zu überprüfen, wurden die Proben wie oben beschrieben 4 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Proben 30 Minuten lang bei 10.000 × g und 4 °C zentrifugiert und 200 μl Überstand mit entweder 2 U Glucosedehydrogenase (Sigma Aldrich, USA) oder Xylosedehydrogenase (Megazyme, Irland) und 5 mM NAD+ inkubiert in 50 mM TRIS pH 8 und die Bildung von Glucose und Xylose wurde dann durch Bestimmung der Reduktion von NAD+ zu NADH gemessen. Alle Enzymtests wurden dreifach durchgeführt.

Enzymatische Reaktionen mit 0,5 % (w/v) Lichenan oder Buchenholz-Xylan wurden unter den gleichen Bedingungen wie für den DNSA-Assay mit 10 µg Phchr2|2915237 durchgeführt. Lichenan und Xylan wurden wie oben beschrieben mit Phchr2|2915237 inkubiert und die Proben wurden nach 1, 2 und 4 Stunden entnommen. Anschließend wurden 2,5 µl der Hydrolyseprodukte und Kontrolllösungen auf Aluminiumfolien-Kieselgel 60/Kieselgur F254-Platten ((20 cm × 20 cm, Merck, Deutschland) aufgetragen und bei Raumtemperatur mit Ethylacetat, Methanol und H2O (68: 23:9, v/v/v) als Lösungsmittel. Die Platten wurden getrocknet und die Produkte sichtbar gemacht, indem die Platten mit einer KMnO4-Färbelösung (1,5 g KMnO4, 10 g K2CO3 und 1,25 ml 10 % wässrige NaOH in 200 ml H2O) behandelt wurden ) und 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten für die Verdauungen wurden über das PRIDE90-Partner-Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/) mit der Datensatzkennung PXD030618 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Alle während dieser Studie generierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten. Alle den Grafiken und Diagrammen zugrunde liegenden Quelldaten finden Sie in den Zusatzdaten 5. Rohdatensätze, die während der aktuellen Studie erstellt wurden, sind auf Anfrage erhältlich.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04290-z

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Wir danken dem Mercur Mercator Research Center Ruhr (Pr-2017-0020, an DB, BS und MK) sowie der DFG (INST 20876/322-1, an MK und FK) für die Förderung.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Geronimo Heilmann

Aktuelle Adresse: Deutsches Diabetes-Zentrum (DDZ), Leibniz-Zentrum für Diabetesforschung an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Düsseldorf, Deutschland

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Christian Schmerling, Leonard Sewald, Geronimo Heilmann.

Molekulare Enzymtechnologie und Biochemie (MEB), Umweltmikrobiologie und Biotechnologie (EMB), Zentrum für Wasser- und Umweltforschung (CWE), Fakultät für Chemie, Universität Duisburg-Essen, Universitätsstraße 5, 45141, Essen, Deutschland

Christian Schmerling, Christopher Bräsen & Bettina Siebers

Abteilung für Chemische Biologie, ZMB, Fakultät für Biologie, Universität Duisburg-Essen, Universitätsstraße 2, 45117, Essen, Deutschland

Leonard Sewald, Geronimo Heilmann, Farnusch Kaschani & Markus Kaiser

Evolution von Pflanzen und Pilzen, Ruhr-Universität Bochum, Universitätsstraße 150, 44780, Bochum, Deutschland

Frederick Witfeld & Dominik Begerow

Novozymes, Biologiens vej 2, 2800 kg, Lyngby, Dänemark

Kenneth Jensen

Analytics Core Facility Essen, ZMB, Faculty of Biology, University of Duisburg-Essen, Universitätsstraße 2, 45117, Essen, Germany

Farnusch Kaschani

Abteilung für bioorganische Synthese, Leiden Institute of Chemistry, Universität Leiden, Einsteinweg 55, 2333 CC, Leiden, Niederlande

Herman S. überlebt

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CB, DB, BS und MK konzipierten und gestalteten die Studie; CS, LS, GH, KJ und FW führten alle chemisch-biologischen Experimente durch und analysierten sie. CS und KJ führten Wachstumsstudien und Proteinexpression durch. CS führte Enzymcharakterisierungen durch. HSO stellte die aktivitätsbasierten Sonden bereit. LS, CS, GH und FK führten Massenspektrometrie und zugehörige Datenanalyse durch. CS, LS, BS und MK haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Bettina Siebers oder Markus Kaiser.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Jean-Guy Berrin und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Calvin Henard und Christina Karlsson Rosenthal. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schmerling, C., Sewald, L., Heilmann, G. et al. Identifizierung von Pilz-Lignocellulose-abbauenden Biokatalysatoren, die von Phanerochaete chrysosporium abgesondert werden, mittels aktivitätsbasierter Proteinprofilierung. Commun Biol 5, 1254 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04141-x

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Eingegangen: 21. Februar 2022

Angenommen: 20. Oktober 2022

Veröffentlicht: 16. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04141-x

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