Die Unterdrückung des menschlichen Äpfelsäureenzyms 2 verändert den Energiestoffwechsel und hemmt die Zellatmung

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 548 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das menschliche mitochondriale NAD(P)+-abhängige Äpfelsäureenzym (ME2) ist für seine Rolle im Zellstoffwechsel bekannt, der möglicherweise an Krebs oder Epilepsie beteiligt ist. Wir stellen wirksame ME2-Inhibitoren vor, die auf Cyro-EM-Strukturen basieren und auf die ME2-Enzymaktivität abzielen. Zwei Strukturen von ME2-Inhibitor-Komplexen zeigen, dass 5,5'-Methylendisalicylsäure (MDSA) und Embonsäure (EA) allosterisch an die Fumarat-Bindungsstelle von ME2 binden. Mutagenesestudien zeigen, dass Asn35 und das Gln64-Tyr562-Netzwerk für die Bindung beider Inhibitoren erforderlich sind. Die Überexpression von ME2 erhöht die Pyruvat- und NADH-Produktion und verringert gleichzeitig das NAD+/NADH-Verhältnis der Zelle; ME2-Knockdown hat jedoch den gegenteiligen Effekt. MDSA und EA hemmen die Pyruvatsynthese und erhöhen somit das NAD+/NADH-Verhältnis, was bedeutet, dass diese beiden Inhibitoren Stoffwechselveränderungen durch Hemmung der zellulären ME2-Aktivität stören. Die Stilllegung von ME2 oder die Hemmung der ME2-Aktivität mit MDSA oder EA verringert die Zellatmung und die ATP-Synthese. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass ME2 für den mitochondrialen Pyruvat- und Energiestoffwechsel sowie die Zellatmung von entscheidender Bedeutung ist und dass ME2-Inhibitoren bei der Behandlung von Krebs oder anderen Krankheiten, an denen diese Prozesse beteiligt sind, nützlich sein könnten.

Das Apfelsäureenzym ME ist eine neuartige Klasse oxidativer Decarboxylasen, die die Umwandlung von L-Malat in Pyruvat katalysieren und gleichzeitig NAD(P)+ zu NAD(P)H1,2,3,4 reduzieren. Äpfelsäureenzyme in Säugetieren werden auf der Grundlage ihrer subzellulären Lokalisierung und Cofaktorspezifität in drei Isoformen, ME1, ME2 und ME3, eingeteilt, wobei jede eine bestimmte physiologische Funktion erfüllt. ME1 ist ein zytosolisches NADP+-abhängiges ME, das an der Erzeugung von zytoplasmatischem NADPH für die reduktive Biosynthese und Wiederauffüllung des Zwischenprodukts des Tricarbonsäurezyklus (TCA) durch die umgekehrte Umwandlung von Pyruvat in L-Malat beteiligt ist5,6. ME3 ist ein vernachlässigbar exprimiertes mitochondriales NADP+-abhängiges ME, das möglicherweise am Kreislauf von NADPH in die Mitochondrien beteiligt ist5. ME2 ist ein NAD+- oder NADP+-abhängiges ME, das in Mitochondrien vorkommt und an der Bildung von mitochondrialem NADH und NADPH4,7,8,9 beteiligt ist. ME2 unterscheidet sich von den beiden anderen Säugetier-Isoformen durch seine duale Cofaktor-Spezifität und ein komplexes allosterisches Regulationssystem. Darüber hinaus kooperiert nur die ME2-Isoform mit dem Substrat L-Malat, und Fumarat kann das Enzym allosterisch aktivieren, während ATP seine enzymatische Aktivität hemmt10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.

ME2 wurde ursprünglich in Hepatom-Mitochondrien8 identifiziert und wurde seitdem bei Leukämie, Melanomen, Gliomen und Brustkrebs9,20,21,22 identifiziert, wo es stark mit dem Fortschreiten und Überleben des Krebses assoziiert ist. Infolgedessen wurde es als vielversprechendes Ziel für die Krebstherapie identifiziert23. Es ist auch in Pankreasinseln von Insulinomzellen von Menschen, Ratten und Mäusen vorhanden und kann zur durch Aminosäuren stimulierten Insulinsekretion beitragen und ausreichend Pyruvat für einen erhöhten Fluss des Krebszyklus bereitstellen, wenn die Glukose begrenzt ist24,25. ME2 ist auch für die Proliferation und Differenzierung von Osteoblasten26 erforderlich. Die ME2-Aktivität ist in den synaptischen Mitochondrien im Gehirn äußerst häufig, was darauf hindeutet, dass sie eine Rolle im Pyruvat-Recyclingweg und bei der Aufrechterhaltung von intramitochondrialem reduziertem Glutathion in synaptischen Terminals spielt27. Das ME2-Gen wurde mit Epilepsie-Syndromen in Verbindung gebracht. Mithilfe von Fallkontroll- und familienbasierten Assoziationsmethoden wurde in einer Studie ein Zusammenhang mit idiopathischer generalisierter Epilepsie (IGE) festgestellt.

ME2 wurde mit einem Gen identifiziert, das mit Epilepsie-Syndromen assoziiert ist. In einer Studie wurde es mit dem Gen identifiziert, das mit der idiopathischen generalisierten Epilepsie (IGE) assoziiert ist, wobei sowohl Fall-Kontroll- als auch familienbasierte Assoziationsmethoden verwendet wurden28. Der Haplotyp des Einzelnukleotid-Polymorphismus ME2 (SNP) wurde mit einem erhöhten Risiko für IGE in Verbindung gebracht und prädisponiert für genetisch generalisierte Epilepsie im Jugendalter29.

In Tumorzellen kann die Glutaminolyse über den Tricarbonsäurezyklus mit der Oxidation von Malat zu Pyruvat über ME24,9,30 zusammenwirken. Glutamat und Glutamin werden als Energiequellen in Krebszellen verwendet und ME2 könnte eine entscheidende Rolle bei der Glutaminolyse spielen30,31. ME2 wandelt L-Malat, das aus Glutamin gewonnen wird, in den Mitochondrien in Pyruvat und NAD(P)H30,31,32,33 um. Durch die Produktion von NADH und Pyruvat könnte ME2 eine wichtige Rolle bei der Energieproduktion in schnell proliferierenden Geweben und Tumorzellen spielen8,31,34; Durch die Produktion von NADPH erzeugt ME2 die Reduktionsäquivalente für die Glutathionreduktion35,36.

Es wurde gezeigt, dass ME2 durch p53 negativ reguliert wird und seine Expression Krebszellen vor der durch p5337 verursachten zellulären Seneszenz schützt. Zwei funktionelle Antwortelemente von p53 befinden sich im ersten Intron des ME2-Gens, was darauf hindeutet, dass p53 als Transkriptionsrepressor für ME237 fungieren könnte. Tatsächlich besteht eine wechselseitige regulatorische Beziehung zwischen p53 und Äpfelsäureenzymen, die das irreversible Schicksal der Zelle über den ME2-beteiligten Stoffwechselweg bestimmt38. Wir haben die Bedeutung von ME2 beim kutanen Melanom20 nachgewiesen. Ein ME2-Mangel in Melanomzellen führt zu verringerten ATP-Spiegeln und erhöhten ROS-Spiegeln, was die Aktivität der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) auslöst, die Phosphorylierung und Aktivierung von p53 und letztendlich den Zelltod fördert20. Die Wirkung struktureller Analoga des Malatsubstrats und des allosterischen Aktivators Fumarat auf menschliches ME2 wurde untersucht39,40. Darüber hinaus entdeckte unser Labor einen niedermolekularen Inhibitor, Embonsäure (EA), der ME2-spezifisch ist und das Wachstum von Lungenkrebszellen hemmt und zelluläre Seneszenz induziert41.

Äpfelsäureenzym ist ein Homotetramer oder Dimer von Dimeren, bei dem die Dimer-Grenzfläche enger gekoppelt ist als die Tetramer-Grenzfläche42. Die Kristallstrukturen von menschlichem ME2 im Komplex mit seinen Liganden zeigen, dass jedes Monomer des Enzyms zwei zusätzliche Ligandenbindungsstellen enthält11. Eine Stelle befindet sich an der Dimerschnittstelle und ist für die Bindung des allosterischen Aktivators Fumarat11 verantwortlich. Die andere Stelle, die sich an der Tetramer-Grenzfläche befindet, ist in der Lage, ein anderes Nukleotid wie NAD+ oder ATP zu binden; Diese zweite Nukleotidbindungsstelle wird als „Exo-Stelle“ bezeichnet. Die Nukleotidliganden in der Exo-Stelle haben diskrete biologische Funktionen, zu denen die Regulierung der Quartärstruktur und die Katalyse von ME219 gehören. Menschliches ME2 kann sowohl in offener als auch in geschlossener Form existieren. Die Struktur von menschlichem ME2 in seinem binären Komplex mit dem Cofaktor NAD+ ist repräsentativ für die offene Form I, wohingegen die Struktur von pentären Komplexen wie ME2-Nukleotid (NAD+, NADH oder ATP)-zweiwertiges Kation (Mg2+ oder Mn2+)-Substrat (Pyruvat) repräsentativ ist oder L-Malat-Fumarat ist repräsentativ für die geschlossene Form II des Enzyms10,11,43. Das menschliche ME2-Gen enthält zahlreiche Einzelnukleotidvarianten (SNVs) in der kodierenden Region, die möglicherweise Auswirkungen auf die Funktion des Enzyms haben. Wir haben zuvor festgestellt, dass SNVs in der allosterischen Fumarat-Bindungsstelle und der Exo-Stelle zur Inaktivierung oder Hyperaktivierung von ME2 führen, und die aufgelösten ME2-SNV-Strukturen bieten eine molekulare Grundlage für die Erklärung der abnormalen kinetischen Eigenschaften der SNV-Enzyme44.

In diesem Artikel beschreiben wir die komplexen Strukturen von ME2 und seinen allosterischen Inhibitoren und demonstrieren die schädliche Wirkung der Inhibitoren auf den Strukturübergang; Wir diskutieren auch die Rolle von ME2 im Energiestoffwechsel. Wir untersuchten die Wirksamkeit der allosterischen ME2-Inhibitoren EA und MDSA bei der Hemmung des ME2-vermittelten Pyruvat- und Energiestoffwechsels in drei nicht krebsartigen Zellen und zeigten die Rolle von ME2 im Energiestoffwechsel durch die Steigerung der Pyruvat- und NADH-Produktion, was die ATP-Produktion steigert bei der Antioxidation, wenn die Mitochondrien einem hohen Maß an oxidativem Stress ausgesetzt sind. Dieser Artikel veranschaulicht die allosterische Regulation von Enzymen perfekt und zeigt die Auswirkungen allosterischer Inhibitoren auf deren Struktur und Funktion sowie auf den zellulären Energiestoffwechsel. Außerdem. Mithilfe biochemischer, biophysikalischer und zellulärer Stoffwechselansätze wird die Rolle von ME2 in den Mitochondrien sowie die Rolle von PFK im Zytoplasma erklärt. beide spielen in ihren jeweiligen Organellen eine energieempfindliche Rolle.

Auf der Grundlage der ortsgerichteten Mutagenese der Dimer- oder Tetramer-Grenzflächen, der Fumarat-Bindungsstelle und der Exo-Stelle haben wir zuvor berichtet, dass auch 4,4'-Methylen-bis(3-hydroxy-2-naphthoesäure). bekannt als Embonsäure (EA), kann als allosterischer Inhibitor von ME241 wirken. Darüber hinaus wurden die hemmenden Wirkungen verschiedener Disalicylsäure- und Naphthoesäure-Derivate auf die enzymatische Aktivität von ME2 untersucht (Abb. S1). Die chemischen Strukturen dieser Derivate sind in Tabelle S1 zusammen mit ihren IC50-Werten aufgeführt. Unter diesen Verbindungen hatte eine Disalicylsäure, 5,5'-Methylendisalicylsäure (MDSA), eine bemerkenswerte Hemmwirkung auf ME2 mit einem IC50 von 0,51 µM (Abb. S1a), während Salicylsäure eine vernachlässigbare Hemmwirkung auf ME2 hatte (IC50 = 800,7 µM; Abb. S1b). 3-Benzoylbenzoesäure, die ein MDSA-ähnliches Kohlenstoffgerüst aufweist, hatte mit einem IC50-Wert von 652 µM eine vernachlässigbare Hemmwirkung auf die ME2-Aktivität, wie in Abb. S1b gezeigt.

EA, eine Bis-3-hydroxy-2-naphthoesäure, hatte mit einem IC50 von 1,1 µM eine bemerkenswerte Hemmwirkung auf ME2. (Abb. S1a). Die hemmende Wirkung von 3-Hydroxy-2-naphthoesäure mit einer Hydroxylgruppe an der 5'-Position, 3,5-Dihydroxy-2-naphthoesäure (IC50 von 12,4 µM; Abb. S1b), hat eine größere Hemmwirkung als 3,5 -Dihydroxy-2-naphthoesäure mit einer Hydroxyl- oder Bromgruppe an der 7'-Position, 3,7-Dihydroxy-2-naphthoesäure und 7-Brom-3-hydroxy-2-naphthoesäure (IC50-Werte von 37,6 µM und 307,8 µM). ; Abb. S1b). Naphthoesäurederivate mit benachbarten Hydroxylgruppen, wie 1-Hydroxy-2-naphthoesäure und 3-Hydroxy-2-naphthoesäure, zeigen eine deutlich geringere hemmende Wirkung auf die Aktivität als EA (IC50-Werte von 74,7 µM bzw. 105,4 µM; Abb . S1b). 2,6-Dicarboxynaphthalin, ein Naphthalin, das Dicarbonsäure enthält, hatte mit einem IC50-Wert von 352,9 µM eine vernachlässigbare Hemmwirkung auf die ME2-Aktivität (Abb. S1b).

Im aktiven Zentrum von MEs sind die für die Substrat- und Metallbindung notwendigen Reste im Wesentlichen über ME1 und ME23,10,42,43 hinweg konserviert. ME2, aber nicht ME1, ist ein allosterisches Enzym, und Fumarat oder Nukleotide binden an bestimmte allosterische Stellen, um die ME2-Aktivität zu modulieren3,11,12,16,17,19. Tatsächlich fehlt ME1 im Gegensatz zu ME2 eine allosterische Stelle an der Dimerschnittstelle, sodass es nicht durch Fumarat aktiviert werden kann3,15. Sequenzvergleiche und kinetische Studien belegen diese Möglichkeit12,16,17,45. Die überwiegende Mehrheit der Reste der allosterischen Stelle in ME2 ist in ME1 nicht konserviert. Folglich kann ME1 nicht durch Fumarat aktiviert werden, und es liegt nahe, dass ME1 möglicherweise nicht empfindlich gegenüber allosterischen Inhibitoren ist.

ME2 reagiert sehr empfindlich auf MDSA- und EA-Hemmung, während ME1 deutlich weniger empfindlich ist, was darauf hindeutet, dass beide Inhibitoren an allosterische Stellen binden. In diesem Artikel demonstrieren wir die Kryo-EM-Strukturen von ME2-MDSA und ME2-EA und zeigen, dass sich die Bindungsstelle für die ME2-spezifischen Inhibitoren MDSA und EA an der allosterischen Fumarat-Bindungsstelle der Dimer-Grenzfläche befindet (Abb. 1). Die Struktur zeigt, dass Asp37 in ME1 die Bindung von MDSA und EA sterisch behindern kann, während Glycin der entsprechende Rest in ME2 ist.

a Kryo-EM-Strukturen des ME2-NAD+-Binärkomplexes mit einer Auflösung von ∼ 2,7 Å. Die Exo-Site NAD+ ist blau hervorgehoben. Die Kontur der Karte liegt 6,7 σ über dem Mittelwert. b Kryo-EM-Struktur des ternären ME2-NAD+-EA-Komplexes bei einer Auflösung von ∼ 2,7 Å. Der Inhibitor EA ist orange hervorgehoben. Das NAD+ im aktiven Zentrum ist rot und das NAD+ im Exo-Zentrum ist blau gefärbt. Die Karte ist mit 8,3 σ konturiert. c Kryo-EM-Struktur des ternären ME2-NAD+-MDSA-Komplexes bei ∼ 2,8 Å Auflösung. Der Inhibitor MDSA ist in grüner Farbe dargestellt. Das NAD+ im aktiven Zentrum ist rot und das NAD+ im Exo-Zentrum ist blau gefärbt. Die Karte ist bei 8 σ konturiert. d Cartoon-Darstellungen des ME2-Binärkomplexes mit der Exo-Stelle NAD+ (blaue Kugeln). Die allosterischen Stellen (angezeigt durch rote gestrichelte Kreise), die aktiven Stellen (angezeigt durch violette gestrichelte Kreise) und die Exo-Stellen (angezeigt durch rosa gestrichelte Kreise) werden gezeigt. Vertikale und horizontale gestrichelte Linien bezeichnen die Dimer- bzw. Tetramer-Grenzflächen. e ternärer ME2-Komplex mit dem allosterischen Zentrum EA (orangefarbene Kugeln), dem aktiven Zentrum NAD+ (rote Kugeln) und dem exo-Zentrum NAD+ (blaue Kugeln). f ME2 ternärer Komplex mit dem allosterischen Zentrum MDSA (grüne Kugeln) und dem aktiven Zentrum NAD+ (rote Kugeln) und dem Exo-Zentrum NAD+ (blaue Kugeln).

Die Kryo-EM-Struktur von menschlichem ME2 in ternären Komplexen mit NAD und Inhibitoren (EA oder MDSA) wurde mit einer Auflösung von 2,72 Å bzw. 2,82 Å bestimmt (Abb. S2 und Tabelle S2). Zusätzlich haben wir die Kryo-EM-Struktur von menschlichem ME2 in Abwesenheit des Inhibitors mit einer Auflösung von 2,72 Å bestimmt (Abb. S2 und Tabelle S2). Die inhibitorfreien ME2-, EA-ME2- und MDSA-ME2-Einzelpartikel-Kryo-EM-Analysen wurden als repräsentatives Kryo-EM-Bild, referenzfreie 2D-Klassenmittelwerte, Auflösungskarten für die endgültigen Rekonstruktionen und Goldstandard-FSC-Diagramme für angezeigt die 3D-Rekonstruktionen und die Euler-Winkelverteilung der Partikelbilder (Abb. S2a–e). Die Datenverarbeitungsabläufe für die inhibitorfreie ME2-Struktur, ME2-EA und ME2-MDSA sind in den Abbildungen dargestellt. S3–S5.

Die gesamte Kryo-EM-Struktur von tetramerem, inhibitorfreiem ME2 (Abb. 1a und 1d) ist vergleichbar mit der des binären Komplexes mit NAD+42. Wie im zweidimensionalen Klassenmittel der elektronenmikroskopischen Bilder (Abb. S2b) gezeigt, sind die vier Monomere in den vier Ecken der Struktur positioniert. In der Kryo-EM-Struktur von menschlichem ME2 ohne Inhibitor wurde die Probe in Abwesenheit der Cofaktoren NAD+ gereinigt und nur ein NAD+-Molekül wird an der Exo-Stelle der ME2-Untereinheit beobachtet (Abb. 1a und 1d). Das aktive Zentrum der inhibitorfreien Struktur ist dem Lösungsmittel ausgesetzt, ähnlich wie bei der offenen Form von ME242.

Beide ME2-Inhibitor-Komplexe (ME2-EA und ME2-MDSA) wurden in Gegenwart der Cofaktoren NAD+ und Mg2+, des natürlichen Substrats Pyruvat (PYR) und des Inhibitors (EA oder MDSA) erzeugt, aber die Strukturen zeigen, dass nur die Der Inhibitor (EA oder MDSA) bindet an die allosterische regulatorische Stelle an der Dimer-Grenzfläche (Abb. 1b bzw. c), während NAD+-Moleküle in jedem aktiven Zentrum und an jeder Exo-Stelle an der Tetramer-Grenzfläche erscheinen (Abb. 1e, f). Der Nicotinamid-Mononukleotid (NMN)-Teil von NAD+ weist in diesen drei Kryo-EM-Strukturen des menschlichen ME2 (Abb. 1) erheblich geringere Elektronendichten auf, was darauf hindeutet, dass er möglicherweise stark ungeordnet ist. Die schlecht aufgelöste NMN-Komponente von NAD+ ist auch in der Kristallstruktur von ME211 zu sehen.

Frühere Strukturstudien haben die offenen und geschlossenen Konformationen von ME2 aufgedeckt, die dem inaktiven bzw. aktiven Zustand des Enzyms entsprechen. In der inaktiven offenen Form ist das aktive Zentrum vollständig dem Lösungsmittel ausgesetzt. Nach der Bindung von zweiwertigen Kationen (Mn2+ oder Mg2+) und Substraten (Malat oder Pyruvat) wird der Verschluss des aktiven Zentrums überwiegend durch die Starrkörperbewegung der Domäne des aktiven Zentrums in Richtung des allosterischen Zentrums vermittelt. Dadurch sind zweiwertige Kationen und Substrate in der aktiven geschlossenen Form vor dem Lösungsmittel geschützt3,44.

In den Strukturen, die gebundene Inhibitoren enthalten (ME2-EA und ME2-MDSA), sind sowohl EA als auch MDSA an die allosterische Stelle an der Dimer-Grenzfläche gebunden. Im Gegensatz zum Fumarat erfordert die Sperrigkeit beider Inhibitoren zusätzlichen Platz und drängt so die Domäne B in Richtung des aktiven Zentrums. Diese Bewegung verändert die räumlichen Positionen von Glu255, Asp256 und Asp279. Arg165 ersetzt Asp256 gezielt an der Seitenkettenposition. Es wurde gezeigt, dass die hochkonservierten Aminosäuren Glu255, Asp256 und Asp279 für die Katalyse und Chelatisierung zweiwertiger Ionen im aktiven Zentrum von MEs3,10,11,43 erforderlich sind. Daher führen die durch EA und MDSA induzierten räumlichen Anordnungen zum Verlust zweiwertiger Ionen am aktiven Zentrum und hemmen die Katalyse.

Fumarat kann die katalytische Aktivität von menschlichem ME2 auslösen, und der allosterische Aktivator wurde an der Dimer-Grenzfläche gefunden (Abb. 2d), etwa 30 Å von jedem aktiven Zentrum entfernt (Abb. 1). Der Aktivator interagiert mit den Seitenketten von Arg67 und Arg91 in der allosterischen Region (Abb. 2d), und Mutagenesestudien bestätigen die Bedeutung der Arg67- und Arg91-Reste bei der Fumaratbindung11,43.

Die Strukturen veranschaulichen die Ligandenwechselwirkungen der allosterischen Stelle (obere Felder) und die Coulomb-Oberflächen, die die allosterische Stelle umgeben (untere Felder). Die grauen Netze stellen die Ligandendichten dar und die Stäbchen stellen die interagierenden Reste dar. Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen werden durch cyanfarbene Linien, Kation-π-Wechselwirkungen durch grüne Linien und Ionenpaare durch magentafarbene Linien angezeigt. a, e Der Inhibitor EA ist im ME2-EA-Komplex in orangefarbenen Stäbchen dargestellt. Die Kontur der Karte liegt 6,5 σ über dem Mittelwert. b, f MDSA ist im ME2-MDSA-Komplex in grünen Stäbchen dargestellt. Die Karte ist mit 7,5 σ konturiert. c, g Allosterische Stelle des inhibitorfreien ME2. d, h Der Aktivator Fumarat ist in dunklen Cyan-Stäbchen in der geschlossenen ME2-Form dargestellt (PDB-ID: 1PJ3). Die Karte ist mit 1,8 σ konturiert. Coulomb-Oberflächen wurden mit den Standardeinstellungen in UCSF Chimera55 berechnet.

Die Kryo-EM-Struktur des ME2-Inhibitor-Komplexes (ME2-EA und ME2-MDSA) zeigt den Inhibitor EA oder MDSA an der allosterischen regulatorischen Region der Dimer-Grenzfläche (Abb. 1b bzw. c). EA interagiert mit ME2 über Ionenpaarungen, Kation-Pi-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen mit umgebenden Aminosäuren (Abb. 2a). Die Reste Arg67 und Arg91 weisen Kation-π-Wechselwirkungen mit EA auf, während Arg91 zusätzlich ein Ionenpaar mit EA bildet. Asn35, Asn92 und Gln64 interagieren mit EA über Wasserstoffbrückenbindungen, und zwischen den Seitenketten Gln64, Asn92 und Tyr562 bestehen Wasserstoffnetzwerke (Abb. 2a).

MDSA bildet Ionenpaare mit benachbarten Untereinheitsresten Arg67 und Arg128, wohingegen Arg91 mit MDSA über eine Kation-π-Wechselwirkung interagiert. Gln64 bildet Wasserstoffbrücken mit MDSA, und zwischen den Seitenketten Gln64, Asn92 und Tyr562 existieren auch Wasserstoffnetzwerke (Abb. 2b). Im Vergleich zur ME2-Struktur ohne Inhibitor (Abb. 2c) verschiebt sich Arg91 aus dem ME2-EA-Komplex leicht in Richtung EA und bildet eine Kation-Pi-Wechselwirkung (Abb. 2a). In der Struktur des ME2-MDSA-Komplexes ändert nicht nur die Seitenkette von Arg91 ihre Richtung in Richtung MDSA, sondern auch die Seitenkette von Arg128 einer anderen Untereinheit wird verschoben und interagiert mit dieser (Abb. 2b). Im Gegensatz zu Fumarat, das hauptsächlich über Ionenpaar-Wechselwirkungen mit den Seitenketten von Arg67 und Arg91 interagiert (Abb. 2d), interagieren die Inhibitoren EA und MDSA hauptsächlich über Ionenpaar- und Kation-Pi-Wechselwirkungen mit den Seitenketten von Arg67 und Arg91 ( Abb. 2a, b). Die Tasche der allosterischen Stelle ist erweiterbar, sodass sie Moleküle aufnehmen kann, die größer als Fumarat sind, wie z. B. EA und MDSA (Abb. 2e – h).

Die vier aktiven Stellen befinden sich in den Ecken der menschlichen ME2-Tetramerstruktur, etwa 60 Å voneinander entfernt (Abb. 1). Die Kryo-EM-Struktur der offenen ME2-Form ohne Inhibitor ist ein binärer Komplex mit nur der Exo-Stelle NAD+; Die aktiven Zentren haben keine Liganden und sind vollständig dem Lösungsmittel ausgesetzt. (Abb. 3c). Die geschlossene Form von ME2 ist ein Pentarkomplex mit dem Naturstoff Pyruvat, dem Cofaktor NAD+, Mn2+ und Fumarat3,43. Trotz der Zugabe von Pyruvat während der Kryo-EM-Präparation beider Proben (Abb. 1b bzw. c) wurde das Substrat Pyruvat in den ternären Komplexstrukturen ME2-EA und ME2-MDSA nicht nachgewiesen, und das aktive Zentrum enthielt nur NAD+ Molekül (Abb. 3a, b).

Die Strukturen veranschaulichen die Ligandenwechselwirkungen von NAD+ im aktiven Zentrum (a, b, c und d) und den Coulomb-Oberflächen, die das aktive Zentrum umgeben (e, f, g und h). Die grauen Netze stellen die Ligandendichten dar und die Stäbchen stellen die interagierenden Reste dar. Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen werden durch cyanfarbene Linien, Kation-π-Wechselwirkungen durch grüne Linien und Ionenpaare durch magentafarbene Linien angezeigt. In den oberen Feldern ist nur der ADP-Anteil des NAD+-Moleküls dargestellt. a, e Das NAD+ im aktiven Zentrum und die interagierenden Reste sind als hellblaue Stäbchen im ME2-EA-Komplex dargestellt. Die Kontur der Karte liegt 5 σ über dem Mittelwert. b, f Das NAD+ im aktiven Zentrum und die interagierenden Reste sind als rosafarbene Stäbchen im ME2-MDSA-Komplex dargestellt. Die Kontur der Karte liegt 7,5 σ über dem Mittelwert. c, g Das NAD+ wurde im aktiven Zentrum nicht beobachtet und die Reste rund um die Tasche im inhibitorfreien ME2 sind als graue Stäbchen dargestellt. d, h Das NAD+ im aktiven Zentrum und die interagierenden Reste sind als gelbe Stäbchen in der geschlossenen ME2-Form dargestellt (PDB-ID: 1PJ3). Die Kontur der Karte liegt 1,5 σ über dem Mittelwert. Coulomb-Oberflächen wurden mit den Standardeinstellungen in UCSF Chimera55 berechnet.

Das Substrat Pyruvat, der Cofaktor NAD+ und die zweiwertigen Kationen Mg2+ sind alle in der geschlossenen Form des aktiven Zentrums von ME2 an die umgebenden Reste gebunden (Abb. 3d) und in der tiefen Spalte abgeschirmt (Abb. 3h). Vergleicht man die aktiven Zentren in den Strukturen von ME2-EA und ME2-MDSA sowie in den offenen und geschlossenen Formen von ME2, so liegen die aktiven Zentren von ME2-EA (Abb. 3a) und ME2-MDSA (Abb. 3b) in einer Offener Zustand ähnlich der offenen Form von ME2 (Abb. 3c), was darauf hinweist, dass die Bindung von EA und MDSA die Enzymkonformation in der katalytisch inaktiven offenen Form blockiert. Die NAD+-Tasche im aktiven Zentrum ist leicht geöffnet, was dazu führen kann, dass die NMN-Einheit flexibler wird (Abb. 3e–h).

Die menschliche ME2-Exo-Stelle in jeder Untereinheit befindet sich an der Tetramer-Grenzfläche, etwa 35 Å vom aktiven Zentrum entfernt (Abb. 1). Unsere Kryo-EM-Strukturen der ternären Komplexe ME2-EA und ME2-MDSA sowie der offenen Form von ME2 zeigen, dass nur der ADP-Teil des NAD+-Moleküls in den Exo-Stellen von ME2 geordnet ist (Abb. S6). im Einklang mit früheren kristallographischen Beobachtungen (PDB-ID: 1PJ3, Abb. S6d). Die Adeninbase von NAD+ bildet Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Amid von Arg194 und dem Carbonyl von Arg556, während die Seitenketten von Arg197 Wasserstoffbrückenbindungen mit der Ribose von NAD+ bilden. Zwischen den Phosphatgruppen von NAD+ und den Seitenketten von Arg542 und Arg556 werden Wasserstoffbrückenbindungen gebildet (Abb. S6a, S6b und S6c). Ein Vergleich der Ligandenwechselwirkungen von NAD+ an der Exo-Stelle in den Strukturen von ME2-EA und ME2-MDSA und den offenen und geschlossenen Formen von ME2 zeigt, dass die ADP-Anteile in ihnen ähnlich ausgerichtet sind (Abb. S6).

Basierend auf den Strukturen von ME2-EA und ME2-MDSA haben wir 16 ME2-Mutanten entworfen und ihre Anfälligkeit für MDSA- oder EA-Hemmung bewertet, um zu bestimmen, welche Aminosäurereste für die Bindung und Hemmung von MDSA oder EA erforderlich sind (Abb. S7). Arg67 und Arg91 sind die direkten Liganden von Fumarat; Sowohl die R67A- als auch die R91A-Mutante waren weniger empfindlich gegenüber MDSA oder EA und zeigten erhöhte IC50-Werte (Tabelle 1). Da Arg67 der Ligand ist, der direkt mit MDSA interagiert, zeigte die R67A-Mutante eine Aktivität, die durch MDSA deutlich weniger gehemmt wurde, mit einem IC50-Wert von 185 µM, was mehr als dem 300-fachen des WT entsprach (Tabelle 1). Arg67 und Glu59 bilden eine Salzbrücke und Glu59 ist mit Lys57 ionengepaart. Die K57- und E59-Mutanten blieben jedoch anfällig für MDSA- oder EA-Hemmung, wobei die IC50-Werte mit denen des WT vergleichbar waren (Tabelle 1).

Gln64 dient als primärer Ligand für die MDSA- oder EA-Bindung, während Tyr562 eine Wasserstoffbrücke mit Gln64 bildet. Q64N hatte IC50-Werte von 62,4 µM und 38,2 µM und Y562A hatte IC50-Werte von 40,8 µM und 46,1 µM für MDSA bzw. EA, Werte, die offensichtlich höher waren als die für WT (Tabelle 1), was darauf hinweist, dass Gln64-Tyr562 Das Paar ist für die MDSA- oder EA-Bindung an der allosterischen Stelle erforderlich.

Aufgrund der direkten Bindung von Asn35 an EA war der IC50-Wert von N35D 10-fach höher als der von WT, wohingegen die IC50-Werte von N35A und N35Q 70- bzw. 160-fach höher waren als die von WT (Tabelle 1). Dies weist darauf hin, dass die strukturelle Spezifität der Seitenkette von Asn35 für die EA-Bindung entscheidend ist. Folglich waren die N35-Mutanten trotz der Tatsache, dass Asn35 nicht direkt mit MDSA interagiert, aufgrund des Seitenketteneffekts von Asn35 weniger anfällig für eine MDSA-Hemmung. Asn92 hat eine direkte Wechselwirkung mit EA, während Arg128 eine direkte Wechselwirkung mit MDSA hat. Beide Reste sind für die MDSA- oder EA-Bindung nicht erforderlich, was durch die Tatsache angezeigt wird, dass die IC50-Werte der N92A-, N92Q- und R128A-Mutanten nicht deutlich erhöht waren, was darauf hindeutet, dass diese Mutanten weiterhin anfällig für MDSA- oder EA-Hemmung waren (Tabelle 1).

Während diese Inhibitor-bindenden Mutanten von ME2 ein breites Spektrum an kinetischen Eigenschaften aufweisen (Tabelle S3) und die Mehrheit unempfindlich gegenüber dem allosterischen Aktivator Fumarat ist (Abb. S8), wie bereits in der Literatur berichtet, sind ihre Sekundärstrukturen insgesamt recht ähnlich diejenigen des WT (Abb. S9), was darauf hinweist, dass die Mutation dieser Reste nicht zu wesentlichen Konformationsänderungen führte und die Anfälligkeit der ME2-Mutanten für MDSA- oder EA-Hemmung durch die lokale Geometrie der allosterischen Stelle von ME2 bestimmt wurde.

MDSA und EA wurden eingeführt, um ihre hemmende Wirkung auf zelluläres ME2 in drei nicht krebsartigen Zelllinien zu bestimmen: HEK293T (humane embryonale Nieren-293-Zellen), HFL-1 (humane Lungenfibroblastenzellen) und MRC-5 (humane embryonale Lungenfibroblastenzellen). ) und zwei Krebszelllinien: H1299 (menschliches nichtkleinzelliges Lungenkarzinom) und MCF-7 (menschliches Brustadenokarzinom). Alle fünf Zelllinien zeigten eine ME2-Expression (Abb. S10a – 10d). Wir haben auch stabile HEK293T-Zellen mit ME2-Überexpressionsplasmiden (pcDNA3-Vektor und pcDNA3-ME2; Abb. S10e) und mit shRNA für den ME2-Knockdown (shCon und shME2; Abb. S10a) als positive bzw. negative Kontrolle etabliert.

ME2 katalysiert die Oxidation von Malat, gefolgt von der Reduktion von NAD+ oder NADP+ zu Pyruvat und NADH oder NADPH. Als Ergebnis wurden die Pyruvat-, NADH- und NADPH-Spiegel sowie das NAD+/NADH-Verhältnis zunächst in ME2-überexprimierenden und ME2-knockdown HEK293T-Zellen bestimmt (Abb. 4). ME2-überexprimierende Zellen hatten erhöhte Pyruvat- und NADH-Spiegel und ein verringertes NAD+/NADH-Verhältnis (Abb. 4a, b, c), wohingegen ME2-stummgeschaltete Zellen verringerte Pyruvat- und NADH-Spiegel und ein erhöhtes NAD+/NADH-Verhältnis aufwiesen ( Abb. 4a, b, c). Bei Behandlung mit MDSA oder EA waren HEK293T-, HFL-1- und MRC-5-Zellen auch anfällig für ME2-Hemmung. Die Behandlung mit EA oder MDSA hemmte wirksam die ME2-Aktivität in HEK293T-, HFL-1- und MRC-5-Zellen, was zu einer Verringerung der Pyruvat- (Abb. 4a, d bzw. S11a) und NADH-Spiegel (Abb. 4b, e und S11a) führte S11b) und ein Anstieg des NAD+/NADH-Verhältnisses (Abb. 4c, f bzw. S11c), ähnlich denen der ME2-Stille (Abb. 4a–c).

Die fache Änderung der zellulären Pyruvat- und NADH-Spiegel, des NAD+/NADH-Verhältnisses, von ATP, NADPH und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) bei ME2-Überexpression (ME2-Over), ME2-Knockdown (ME2-KD), EA-behandeltem, und MDSA-behandelte Zellen. a Die fache Veränderung der Pyruvatspiegel in HEK293T-Zellen. N = 3-4. T-Test des ungepaarten Studenten. *p < 0,05, ***p < 0,001. b Die NADH-Spiegel in HEK293T-Zellen verändern sich um ein Vielfaches. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. *p < 0,05, ***p < 0,001. c Das Verhältnis von NAD+/NADH in HEK293T-Zellen. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. d Die fache Änderung der Pyruvatspiegel in HFL-1-Zellen. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. **p < 0,01, ***p < 0,001. e Die fache Änderung der NADH-Spiegel in HFL-1-Zellen. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. **p < 0,01, ***p < 0,001. f Die fache Änderung des Verhältnisses von NAD+/NADH in HFL-1-Zellen. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. *p < 0,05, **p < 0,01. g Die fache Änderung der ATP-Spiegel in HEK293T-Zellen. N = 3-4. T-Test des ungepaarten Studenten. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. h Die fache Änderung der NADPH-Spiegel in HEK293T-Zellen. N = 3-4. T-Test des ungepaarten Studenten. **p < 0,01. ns, keine statistische Signifikanz. i Die fache Änderung der ROS-Spiegel in HEK293T-Zellen. N = 3-4. T-Test des ungepaarten Studenten. **p < 0,01. ns, keine statistische Signifikanz. j Die fache Änderung der ATP-Spiegel in HFL-1-Zellen. N = 3-4. T-Test des ungepaarten Studenten. *p < 0,05, **p < 0,01. k Die fache Änderung der NADPH-Spiegel in HEK293T-Zellen. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. **p < 0,01. l Die fache Änderung der ROS-Spiegel in HEK293T-Zellen. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. *p < 0,05, **p < 0,01. Die Balkendiagramme veranschaulichen die fache Veränderung der Konzentrationen dieser Metaboliten nach 48 Stunden. Fehlerbalken sind Mittelwerte ± SD.

Das NAD+/NADH-Verhältnis und der ATP-Spiegel in der Zelle sind entscheidende Indikatoren für den Energiestoffwechsel. ME2-überexprimierende Zellen hatten ein niedrigeres NAD+/NADH-Verhältnis (Abb. 4c) und höhere ATP-Werte (Abb. 4g), wohingegen ME2-stummgeschaltete Zellen das Gegenteil erlebten (Abb. 4c, g), was darauf hinweist, dass ME2 positiv mit der Energie korreliert Stoffwechsel. Die Behandlung mit EA oder MDSA erhöhte das NAD+/NADH-Verhältnis und senkte die ATP-Spiegel in HEK293T-Zellen (Abb. 4c bzw. g). Ähnliche Ergebnisse wurden in EA- oder MDSA-behandelten HFL-1- und MRC-5-Zellen beobachtet. Die EA- oder MDSA-Behandlung in HEK293T-, HFL-1- und MRC-5-Zellen führte zu einer Abnahme der ATP- (Abb. 4g, j bzw. S11d) und NADH-Spiegel (Abb. 4b, e bzw. S11b). Dies deutet darauf hin, dass MDSA und EA in der Lage waren, den Energiestoffwechsel der Zelle durch Hemmung der ME2-Aktivität negativ zu regulieren.

Der Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in mit MDSA oder EA behandelten HEK293T-Zellen blieb konstant (Abb. 4i), was unveränderten NADPH-Werten entsprach (Abb. 4h). In MRC-5-Zellen führte die EA-Behandlung zu einer Verringerung der NADPH-Produktion (Abb. S11e), was zu einem Anstieg des ROS-Spiegels führte (Abb. S11f). Nach der Behandlung mit MDSA oder EA produzierten HFL-1-Zellen auch weniger NADPH (Abb. 4k), während gleichzeitig die Produktion von ROS zunahm (Abb. 4l). Es ist möglich, dass der oxidative Stress, der durch erhöhte ROS und verringerte NADPH in HFL-1-Zellen verursacht wird, die Ursache für den größten Effekt der MDSA- oder EA-Behandlung auf die Zelllebensfähigkeit ist, der bei HFL-1-Zellen beobachtet wurde (Abb. S12c). Die HFL-1-Zelle war die anfälligste der drei nicht krebsartigen Zellen für die MDSA- oder EA-vermittelte ME2-Hemmung (Abb. S12a – S12c); Dies war auf die Tatsache zurückzuführen, dass MDSA und EA eine ausgeprägte unterdrückende Wirkung darauf hatten und nicht nur die Pyruvat- und NADH-Spiegel (Abb. 4d bzw. 4e), sondern auch die NADPH-Spiegel (Abb. 4k) senkten.

Wir untersuchten weiterhin die Wirksamkeit von EA oder MDSA auf ME2-assoziierte Stoffwechselveränderungen in den Krebszelllinien H1299 und MCF-7 (Abb. 5 bzw. S13). ME2 wurde in beiden Zelllinien gefunden (Abb. S10d). Es war faszinierend, dass H1299-Zellen empfindlich auf EA oder MDSA reagierten, was durch eine Verringerung der Pyruvat-, ATP- und NADPH-Produktion und einen Anstieg der ROS-Produktion belegt wurde (Abb. 5a–d). Ein Anstieg der ROS und eine Abnahme des NADPH in H1299-Zellen führten zu einer offensichtlichen Zellmortalität (Abb. S12d). Im Gegensatz dazu haben weder EA noch MDSA wesentliche Auswirkungen auf den ME2-gesteuerten Metabolismus in MCF-7-Zellen (Abb. S13a – S13d) oder die Zelllebensfähigkeit in MCF-7-Zellen (Abb. S12e), was darauf hindeutet, dass das Arzneimittel eine Wirkung auf ME2 hat -exprimierten Zellen ist variabel.

Die proportionale Änderung von zellulärem Pyruvat, ATP, NADPH und ROS in H1299-Zellen in Gegenwart von EA oder MDSA (0, 75 und 150 µM). a Die fache Veränderung des Pyruvatspiegels. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. *p < 0,05. b Die fache Änderung der ATP-Spiegel. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. **p < 0,01. c Die fache Änderung der NADPH-Werte. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. **p < 0,01. d Die fache Änderung der ROS-Werte. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. *p < 0,05. e Die Sauerstoffverbrauchsrate in EA-behandelten H1299-Zellen. N = 3. f Die Grundatmungsfrequenz. N = 7, 8 und 11, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. *p < 0,05, ***p < 0,001. g Die maximale Atemfrequenz. N = 7, 8 und 11, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. **p < 0,01, ***p < 0,001. h ATP-Produktion. N = 7, 6 und 11, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. *p < 0,05, ***p < 0,001. i Die freie Atemkapazität. N = 7, 8 und 11, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. *p < 0,05, ***p < 0,001. j Die Sauerstoffverbrauchsrate in MDSA-behandelten H1299-Zellen (N = 3–5). k Die Basalatmungsfrequenz. N = 7, 16 und 13, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. ***p < 0,001. l Die maximale Atemfrequenz. N = 7, 16 und 13, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. *p < 0,05, ***p < 0,001. m ATP-Produktion. N = 7, 16 und 13, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. ***p < 0,001. n Die freie Atemkapazität. N = 8, 16 und 13, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. ns, keine statistische Signifikanz. Fehlerbalken sind Mittelwerte ± SD. Oligo: Oligomycin; FCCP: Carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Rot/Ameisen: Rotenon/Antimycin A.

Massenspektrometrie wurde verwendet, um die Veränderungen der Pyruvat-, Malat-, Phosphoenolpyruvat- (PEP) und Glukosespiegel nach MDSA- oder EA-Behandlung zu bestimmen (Abb. S14). Die Hemmung von ME2 durch MDSA oder EA führte erwartungsgemäß zu einem Rückgang des Pyruvats (Abb. 4 und S14). Andererseits blieb der zelluläre Malatspiegel relativ konstant, was darauf hindeutet, dass die Hemmung der ME2-Aktivität nicht zu einer Malatakkumulation führt (Abb. S14). Darüber hinaus hatte die Hemmung der ME2-Aktivität keinen Einfluss auf die zellulären PEP- und Glukosespiegel (Abb. S14). Aufgrund dieser Ergebnisse kann der Schluss gezogen werden, dass die ME2-Hemmung die Pyruvatbildung verringerte, ohne die Glykolyse zu beeinträchtigen.

Wir führten Experimente zur Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) durch, um die Atmungskapazität und die Menge an ATP zu bestimmen, die durch oxidative Phosphorylierung produziert wird (Abb. 6). Der Agilent Seahorse XF-Analysator wurde zur Messung der Zellatmung von ME2-stummgeschalteten Zellen sowie von MDSA- oder EA-behandelten Zellen verwendet. Die OCR war in ME2-stummgeschalteten HEK293T-Zellen erheblich verringert (Abb. 6a), ebenso wie die Grund- und Maximalatmung (Abb. 6b, c), die durch oxidative Phosphorylierung erzeugte ATP-Menge (Abb. 6d) und die Reserveatmung Kapazität (Abb. 6e), was zeigt, dass die ME2-Stille die Zellatmung und die ATP-Produktion erheblich reduziert.

a Die Sauerstoffverbrauchsrate in ME2-Kontroll- (shCon) und ME2-Knockdown- (shME2) HEK293T-Zellen. N = 3–6. b Die Basalatmungsfrequenz. N = 16 und 12, von links nach rechts. T-Test des ungepaarten Studenten. ***p < 0,001. c Die maximale Atemfrequenz. N = 16 und 12, von links nach rechts. T-Test des ungepaarten Studenten. ***p < 0,001. d ATP-Produktion. N = 16 und 13, von links nach rechts. T-Test des ungepaarten Studenten. ***p < 0,001. e Die freie Atemkapazität. N = 16 und 11, von links nach rechts. T-Test des ungepaarten Studenten. **p < 0,01. f Die Sauerstoffverbrauchsrate in EA-behandelten HEK293T-Zellen. N = 3-4. g Die Basalatmungsfrequenz. N = 9, 7 und 10, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. *p < 0,05, ***p < 0,001. h Die maximale Atemfrequenz. N = 9, 7 und 10, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. **p < 0,01, ***p < 0,001. i ATP-Produktion. N = 9, 7 und 10, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. ***p < 0,001. ns, keine statistische Signifikanz. j Die freie Atemkapazität. N = 9, 7 und 10, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. *p < 0,05, ***p < 0,001. k Die Sauerstoffverbrauchsrate in MDSA-behandelten HEK293T-Zellen. N = 3-5. l Die Basalatmungsfrequenz. N = 10, 9 und 10, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. **p < 0,01, ***p < 0,001. m Die maximale Atemfrequenz. N = 9, 9 und 10, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. ***p < 0,001. n ATP-Produktion. N = 9, 9 und 10, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. **p < 0,01, ***p < 0,001. o Die freie Atemkapazität. N = 9, 9 und 10, von links nach rechts. Einfaktorielle ANOVA mit Dunnett-Test. ***p < 0,001. Fehlerbalken sind Mittelwerte ± SD. Oligo Oligomycin, FCCP Carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon, Rot/Ant Rotenon/Antimycin A.

Die OCR war in EA-behandelten Zellen dosisabhängig reduziert (Abb. 6f), ebenso wie die Grundlinie und die maximale Atmung (Abb. 6g, h), die ATP-Synthese (Abb. 6i) und die freie Atmungskapazität (Abb . 6j), was darauf hindeutet, dass EA durch die Hemmung von ME2 die Zellatmung und die ATP-Synthese erheblich reduziert. MDSA hatte ebenfalls die gleichen Wirkungen wie EA (Abb. 6k–6o), war jedoch noch wirksamer; Beispielsweise erfordert die Reduzierung der ATP-Synthese mit MDSA 25 µM (Abb. 6n), wohingegen mit EA mehr als 25 µM erforderlich waren (Abb. 6i).

Zusätzlich wurden OCR-Experimente durchgeführt, um die Wirksamkeit von EA oder MDSA auf H1299- und MCF-7-Krebszelllinien zu bewerten (Abb. 5e–n bzw. S13e–n). Es war offensichtlich, dass EA OCR-Veränderungen in H1299-Zellen hervorrief (Abb. 5e), was durch eine Abnahme der Basal- und Maximalatmung (Abb. 5f bzw. g), der ATP-Produktion (Abb. 5h) und der Ersatzatmung angezeigt wurde Kapazität (Abb. 5i). MDSA induzierte ähnliche OCR-Veränderungen in H1299-Zellen wie EA (Abb. 5j), was durch eine Abnahme der Basal- und Maximalatmung und der ATP-Produktion (Abb. 5k–m), jedoch nicht der Reserveatmungskapazität (Abb. 5n) belegt wird ). MCF-7-Zellen waren im Gegensatz zu H1299-Zellen als Reaktion auf OCR nicht empfindlich gegenüber EA oder MDSA (Abb. S13e bzw. j); Die Grund- und Maximalatmung, die ATP-Produktion und die Ersatzatmungskapazität wurden durch die Behandlung mit EA oder MDSA nicht verändert (Abb. S13f–i bzw. S13k–n); Dieser Befund entsprach der Tatsache, dass MCF-7-Zellen nicht auf den ME2-gesteuerten Metabolismus mit EA oder MDSA reagierten (Abb. S13a – d).

Wir untersuchten die Auswirkungen von EA oder MDSA auf die Migration und Invasion von H1299- und MCF-7-Krebszellen (Abb. 7 und S15). Der Wundheilungstest ergab, dass EA und MDSA die Migration von H1299-Zellen hemmen können (Abb. 7a bzw. S15a). Die relative Wundheilungsrate von EA- oder MDSA-behandelten H1299-Zellen war langsamer als die von unbehandelten Zellen (Abb. 7b bzw. c). Im Gegensatz dazu können EA und MDSA die Migration von MCF-7-Zellen nicht hemmen (Abb. 7d bzw. S15b). Ähnliche Wundheilungsraten wurden zwischen EA- oder MDSA-behandelten MCF-7-Zellen und unbehandelten Zellen beobachtet (Abb. 7e bzw. f).

a Zellmigration (Wundheilungstest) von H1299-Zellen mit EA. b Quantitative Analyse der relativen Wundheilungsraten von H1299-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von EA. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. *p < 0,05. c Quantitative Analyse der relativen Wundheilungsraten von H1299-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von MDSA. N = 4. T-Test des ungepaarten Schülers. **p < 0,01. d Wundheilungstest von MCF-7-Zellen mit EA. e Quantitative Analyse der relativen Wundheilungsraten von MCF-7-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von EA. N = 4. T-Test des ungepaarten Schülers. ns, keine statistische Signifikanz. f Quantitative Analyse der relativen Wundheilungsraten von MCF-7-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von MDSA. N = 4. T-Test des ungepaarten Schülers. ns, keine statistische Signifikanz. g Zellinvasion von H1299-Zellen mit EA. h Faltenveränderungen invasiver H1299-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von EA. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. *p < 0,05. i Faltenveränderungen invasiver H1299-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von MDSA. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. *p < 0,05. j Zellinvasion von MCF-7-Zellen mit EA. k-fache Veränderungen invasiver MCF-7-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von EA. N = 3. T-Test des ungepaarten Schülers. ns, keine statistische Signifikanz. l Faltenveränderungen invasiver MCF-7-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von MDSA. N = 4. T-Test des ungepaarten Schülers. ns, keine statistische Signifikanz. Fehlerbalken sind Mittelwerte ± SD.

Der Invasionstest zeigte, dass EA und MDSA die Zellinvasion von H1299-Zellen hemmen können (Abb. 7g bzw. S15c). Die Faltveränderungen invasiver Zellen in EA- oder MDSA-behandelten H1299-Zellen waren geringer als die von unbehandelten Zellen (Abb. 7h bzw. 7i). Allerdings hemmen weder EA noch MDSA die Invasion von MCF-7-Zellen (Abb. 7j bzw. S15d). Die Anzahl der invasiven Zellen in MCF-7-Zellen hat sich nach der Behandlung mit EA oder MDSA nicht wesentlich verändert (Abb. 7k bzw. l). Zusammenfassend hemmen EA oder MDSA den ME2-assoziierten Stoffwechsel, insbesondere den Energiestoffwechsel, was darauf hindeutet, dass die Hemmung der Zellmigration und -invasion durch EA oder MDSA auf die Unterdrückung der Energieproduktion in Krebszellen zurückzuführen sein könnte.

ME2 wurde sowohl in offener als auch in geschlossener Form mit verschiedenen Liganden kristallisiert, die mit dem aktiven Zentrum, der allosterischen Stelle und der Exo-Stelle assoziiert sind10,11,42,43. Unser Labor hat zuvor die Kristallstrukturen von ME2 bestimmt und dabei herausgefunden, dass es sich bei der Struktur des ME2_R67Q-Mutanten um eine inaktivierende „tote Form“ des Enzyms handelte, während es sich bei der Struktur von ME2_R484W um eine überaktivierende „geschlossene Form“ handelte44. Darüber hinaus ist ME2 ein Dimer von Dimeren, wobei jedes Monomer vier verschiedene Domänen (Domänen A, B, C und D) umfasst. Domäne A (Reste 23–130) ist sowohl an der Tetramerisierung als auch an der Katalyse beteiligt. Ein allosterischer Aktivator Fumarat ist an die Dimerschnittstelle von ME2 gebunden, die Domäne A enthält. Mutationen in der Fumaratbindungsstelle und Domäne A führen häufig zur Inaktivierung des Enzyms44.

In diesem Artikel berichten wir über drei Kryo-EM-Strukturen von ME2: eine offene Form des binären ME2-Komplexes, der nur NAD+ enthält (Abb. 8a), und zwei ternäre ME2-Komplexe, die entweder EA oder MDSA und NAD+ enthalten (ME2-EA-NAD+ oder ME2). -MDSA-NAD+-Komplexe; Abb. 8b bzw. c). Basierend auf diesen Kryo-EM-Strukturen können wir schließen, dass EA und MDSA eher allosterische Inhibitoren als Inhibitoren des aktiven Zentrums sind, da sie an die Dimerschnittstelle in der Nähe der Fumaratbindungsstelle von ME2 binden (Abb. 1) und die Bindung von EA oder MDSA verhindert, dass ME2 zwischen seiner offenen und geschlossenen Form wechselt, und hemmt dadurch seine Aktivität. EA und MDSA verfügen über einzigartige Bindungsmodi, die sich mit dem Bindungsmodus von Fumarat an dieser allosterischen Stelle überschneiden (Abb. 2). Fumarat, ein allosterischer Aktivator, kann die ME2-Aktivität erheblich steigern, indem es K0,5,Malat und Km,NAD senkt und so die Affinität von ME2 zu seinen Substraten erhöht (Abb. 8d und Tabelle S3). Im Gegensatz zur Fumaratbindung, die ME2 zum Übergang von der offenen in die geschlossene Form veranlassen kann, verhindert die EA- oder MDSA-Bindung jedoch, dass ME2 von der offenen zur geschlossenen Form wechselt (Abb. 8b, c), wodurch die ME2-Enzymaktivität gehemmt wird. Somit erhielten wir trotz der Zugabe von Pyruvat, Mg2+, NAD+ und EA (oder MDSA) während der Kryo-EM-Probenvorbereitung keinen ME2-Pentärkomplex mit Pyruvat, NAD+, Mg2+ und EA (oder MDSA). Dies kann daran liegen, dass die Bindung von EA oder MDSA die ME2-Konformation blockiert und das aktive Zentrum für die Pyruvat- und Mg2+-Bindung ungeeignet macht. Die ME2-Hemmung durch EA oder MDSA ist reversibel und Fumarat kann die durch EA oder MDSA gehemmte ME2-Aktivität wiederherstellen, indem es um die allosterische Stelle an der Dimer-Grenzfläche konkurriert (Abb. 8b, d)44. ME2-Aktivität wandelt L-Malat in Pyruvat um, das in den Tricarbonsäurezyklus (TCA) gelangt und dann über die Atmungskette ATP produziert; Wenn also [ATP] erhöht wird, wird die ME2-Aktivität gehemmt (Abb. 8e).

a Der ME2-NAD+-Binärkomplex weist eine inaktive offene Form auf. b Die ternären Komplexe ME2-NAD+-EA und c ME2-NAD+-MDSA liegen ebenfalls in einer inaktiven offenen Form vor. EA oder MDSA können an die allosterische Stelle an der Dimer-Grenzfläche binden und so die ME2-Aktivität hemmen, indem sie die Bindung von ME2-Substraten hemmen und so ME2 in einer inaktiven offenen Form stabilisieren. d Der Pentankomplex ME2-NAD+-PYR-Mn2+-FUM (PDB-Code: 1PJ3) weist eine aktive geschlossene Form auf, und e Der Pentankomplex ME2-ATP-MAL-Mn2+-FUM (PDB-Code: 1PJ4) weist eine inaktive geschlossene Form auf . Um die ME2-Aktivität zu aktivieren, kann Fumarat an die allosterische Stelle an der Dimer-Grenzfläche binden, was die Bindung von ME2-Substraten fördert und so ME2 in einer vollständig aktiven geschlossenen Form stabilisiert. Wenn jedoch der zelluläre ATP-Spiegel erhöht wird, kann ATP mit NAD+ um die Bindung an das aktive Zentrum und Exo-Zentrum konkurrieren, wodurch die ME2-Aktivität gehemmt und ME2 in einem inaktiven geschlossenen Zustand gehalten wird. FUM-Fumarat, PYR-Pyruvat.

Der Regulationsmechanismus von ME2 ist dem der Phosphofructokinase (FPK) recht ähnlich, obwohl beide Enzyme an unterschiedlichen Orten lokalisiert sind; ME2 ist in den Mitochondrien lokalisiert, während PFK im Zytosol lokalisiert ist (Abb. 9a). Unter verschiedenen physiologischen Bedingungen ist ATP der wirksamste allosterische Inhibitor von ME2 und PFK. Durch die Glykolyse entsteht zytosolisches ATP; Wenn der ATP-Spiegel hoch ist, hemmt ATP die PFK und verlangsamt dadurch die Glykolyse. PFK ist inaktiv, es sei denn, die Zelle produziert Fructose-2,6-bisphosphat, ihren allosterischen Aktivator, der an PFK gebunden ist und es aktiviert, um die Glykolyse einzuleiten. Wenn [ATP] erschöpft ist, wird Fructose-2,6-bisphosphat an PFK gebunden, um das Enzym zu reaktivieren, indem die Km der PFK-Substrate gesenkt werden, woraufhin die Glykolyse neu gestartet wird. Wenn der mitochondriale ATP-Spiegel ansteigt, hemmt ATP in ähnlicher Weise ME2 und verringert dadurch die Pyruvatproduktion (Abb. 8e). ME2 ist ebenfalls inaktiv, bis die Zelle ihren allosterischen Aktivator Fumarat produziert, der an ME2 gebunden ist und es aktiviert, um mitochondriales Pyruvat zu erzeugen (Abb. 8d). ME2 ist möglicherweise an der Glutaminolyse beteiligt, und die ME2-Reaktion erzeugt mitochondriales Pyruvat, das dann in Acetyl-CoA umgewandelt wird, das dann zur Erzeugung von zusätzlichem ATP über den TCA-Zyklus und die durch die Elektronentransportkette vermittelte oxidative Phosphorylierung verwendet wird (Abb. 9a). Fumarat ist ein Bestandteil des TCA-Zyklus. Wenn [ATP] erschöpft ist, bindet Fumarat an ME2 und reaktiviert es (Abb. 8d, e), wodurch NAD+ wieder in das aktive Zentrum eingeführt wird und letztendlich Pyruvat für die ATP-Synthese entsteht. Somit sind sowohl ME2 als auch PFK energieempfindliche Enzyme, deren Aktivität durch den Energiezustand der Zelle reguliert wird. ME1 wird nicht durch ATP reguliert, was darauf hinweist, dass es sich nicht um ein energieempfindliches Enzym handelt.

a Eine Verbindung zwischen der ME2-katalysierten Reaktion, dem Tricarbonsäurezyklus (TCA) und der durch die Elektronentransportkette vermittelten oxidativen Phosphorylierung. b ME2-induzierte Stoffwechselveränderungen in Zellen durch Hoch- oder Herunterregulieren von ME2 und durch Behandlung mit den allosterischen ME2-Inhibitoren EA und MDSA.

Pyruvat kann aus zwei Quellen gewonnen werden: aus Glucose gewonnenes Pyruvat aus dem Zytosol und die ME2-katalysierte Umwandlung von mitochondrialem L-Malat in Pyruvat. L-Malat kann in den Mitochondrien unter anderem durch Glutaminolyse, Transaminierung oder den Malat-Aspartat-Shuttle produziert werden (Abb. 9a). Eine Überexpression von ME2 führt zu einem Anstieg der Pyruvat-, NADH- und ATP-Spiegel sowie zu einer Abnahme des NAD+/NADH-Verhältnisses, was darauf hindeutet, dass ME2 für den Energiestoffwechsel essentiell ist (Abb. 9b). Eine zunehmende ME2-Aktivität in den Mitochondrien erhöht dort den NADPH-Spiegel, um der ROS-Produktion entgegenzuwirken, was eine einzigartige Funktion von ME2 in den Mitochondrien darstellt, wohingegen PFK im Zytosol keine antioxidative Fähigkeit besitzt (Abb. 9). ME2-Stille hingegen führt im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einem Rückgang der Pyruvat- und NADH-Spiegel sowie zu einem Anstieg des NAD+/NADH-Verhältnisses. Die Reduzierung des NADPH-Spiegels führt zu einem Anstieg der Produktion von ROS (Abb. 9b). Mechanistisch führt die ME2-Stille zu einer Verringerung der ATP-Produktion, der Basal- und Maximalatmung sowie einer freien Atmungskapazität in der Zelle, was darauf hindeutet, dass ME2-katalysierte Reaktionen für die Zellatmung und die oxidative Phosphorylierung dort entscheidend sind, wie die Ergebnisse dieser Studie zeigen Studie (Abb. 4–6).

Hier haben wir über die Entdeckung zweier allosterischer ME2-Inhibitoren, EA und MDSA, berichtet, die in der Lage sind, die ME2-Aktivität zu hemmen und so die Produktion von zellulärem Pyruvat, NADH und ATP zu verringern. Die Behandlung mit EA oder MDSA führt zu einer Verringerung der Zellatmung und der oxidativen Phosphorylierung in der Zelle (Abb. 9b). Die Behandlung mit EA oder MDSA hat außerdem den zusätzlichen Effekt, dass die NADPH-Produktion verringert wird, was den ROS-Spiegel in der Zelle erhöht, was zum Zelltod führen kann. Mit anderen Worten: Die antioxidative Fähigkeit von ME2 wird durch EA und MDSA unterdrückt, was zu einem verringerten NADPH und einem erhöhten ROS führt. Daher hat ME2 in Mitochondrien zwei Funktionen: Die erste ist die Produktion von Pyruvat und NADH, um durch oxidative Phosphorylierung ATP zu erzeugen, und die zweite ist die Erzeugung von NADPH, um ROS entgegenzuwirken.

ME1 fehlt im Gegensatz zu ME2 eine allosterische Stelle und weist keine duale Cofaktorspezifität auf; Stattdessen wird nur NADP+ als Cofaktor verwendet. Daher ist es verständlich, dass ME2 in vitro anfälliger für eine Hemmung durch EA oder MDSA war als ME1 (Abb. S1a). Da entdeckt wurde, dass EA oder MDSA an der allosterischen Stelle an ME2 bindet, ist es möglich, dass sich die Zielstelle für EA oder MDSA in ME1 an der aktiven Stelle befindet. Dies ist im Hinblick auf die Spezifität für die allosterische Hemmung von ME2 durch EA oder MDSA von Vorteil. Dies impliziert auch, dass der Rückgang der aus Malat stammenden ATP-Produktion auf eine EA- oder MDSA-induzierte ME2-Hemmung zurückzuführen ist. Darüber hinaus reduzierte die Behandlung mit EA und MDSA zwar die Pyruvatproduktion, dies wurde jedoch hauptsächlich durch Hemmung der ME2-Aktivität und nicht durch Hemmung der Glykolyse erreicht, die der primäre Weg für die Pyruvatproduktion ist. Wie die Tatsache zeigt, dass sich die PEP- und Glukosespiegel durch die Behandlung nicht verändert haben (Abb. S14), beeinträchtigt die Hemmung von ME2 durch EA oder MDSA die Glykolyse nicht.

ME2 steht seit langem im Verdacht, ein Onkogen zu sein, es wurde jedoch kein niedermolekularer Inhibitor gefunden, der die ME2-Aktivität wirksam hemmt und den Zelltod verursacht. Wir haben zuvor gezeigt, dass EA zelluläre Seneszenz in der H1299-Zelllinie, einer Lungenadenokarzinomzelle, induzieren kann41. EA und MDSA hemmen wirksam die ME2-Aktivität in submikromolaren Konzentrationen, Zellen benötigen jedoch mikromolare Konzentrationen, um den ME2-gesteuerten Pyruvat- und Energiestoffwechsel zu verhindern. Daher ist die Optimierung der Aufnahme von EA und MDSA in Zellen eine erste Priorität für die zukünftige Forschung zu ME2-assoziierten Krankheiten.

Das menschliche ME2-Protein wurde in Escherichia coli BL21-Färbung unter Verwendung des PRH281-Vektors unter der Kontrolle des trp-Promotors exprimiert, der mit Indol-3-essigsäure (IAA) induziert wurde. ME2 wurde mittels ATP-Agarose-Affinitätschromatographie (Sigma, St. Louis, MO, USA) gereinigt. Das menschliche ME1-Protein wurde in Escherichia coli BL21(DE3) unter Verwendung des pET21b-Vektors unter der Kontrolle des T7-Promotors exprimiert, der mit Isopropyl-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert wurde. ME1 wurde mittels Ni-NTA-Agarose-Affinitätschromatographie (Sigma, St. Louis, MO, USA) gereinigt. Unter Verwendung eines Amicon®Ultra-15-Geräts mit einem Cutoff von 30 KDa wurden die gereinigten Äpfelsäureenzyme dialysiert und gegen einen Lagerungspuffer konzentriert, der 30 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 2 mM -Mercaptoethanol (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) enthielt. Die Reinheit des Proteins wurde mithilfe von SDS-PAGE bestimmt, und die Konzentration des Proteins wurde mithilfe eines kommerziellen Proteintestpuffers (Bio-Rad lab, Inc., Hercules, CA, USA) basierend auf der Bradford-Methode und der Absorption bestimmt bei 595 nm wurde mit einem Multimode-Mikroplattenlesegerät Biotek® (Agilent, Santa Clara, CA, USA) nachgewiesen.

Die ME2-Hemmung wurde durch Titrieren von EA oder MDSA von 0 bis 40 μM in einem Reaktionspuffer bestimmt, der 50 mM Tris-HCl (7,4), 40 mM L-Malat, 2 mM NAD+ und 10 mM MgCl2 enthielt; Die ME1-Hemmung wurde in einem Reaktionspuffer bestimmt, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 15 mM L-Malat, 0,2 mM NADP+ und 10 mM MgCl2 enthielt. Die Hemmung von Disalicyl- und Naphthoesäure-Derivaten gegen ME2 wurde durch Titration eines Bereichs von Inhibitorkonzentrationen (0 bis 500 μM) bestimmt, während die ME2-Substrate bei 40 mM L-Malat, 2 mM NAD+ und 10 mM MgCl2 gehalten wurden. Um den IC50-Wert zu erhalten, kann die Hemmkurve nach folgender Gleichung berechnet werden:

wobei A die Inhibitorkonzentration bezeichnet. Die restliche Enzymaktivität (%) wird unter Verwendung der Kurve von Maximum (100 %) auf Minimum (0 %) normalisiert. Die Steigung der Kurve in der Mitte wird als Bergsteigung bezeichnet. Der IC50-Wert gibt die Konzentration des Inhibitors an, die 50 % der Enzymaktivität hemmt. Zur Durchführung aller Berechnungen wurde Prism 8.0 verwendet (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Das Plasmid pRH281-ME2 wurde unter Verwendung mutagener Primer (Tabelle S4) für 16–18 Thermozyklen mit einer pfuUltra-High-Fidelity-DNA-Polymerase (Agilent, Santa Clara, CA, USA) amplifiziert. Nach der Verdauung mit dem Restriktionsenzym DpnI (TaKaRa, Shiga, Japan) zur Entfernung des Wildtyp-Matrizenplasmids wurden die DNA-Produkte in Escherichia coli XL-10 transformiert. Schließlich wurde die automatische Sequenzierung verwendet, um einzelne ME2-Mutanten zu identifizieren.

Kryo-EM-Proben wurden mit einem Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) hergestellt, der auf 4 ° C und 100 % Luftfeuchtigkeit eingestellt war. Eine Lösung gereinigter Proben (inhibitorfreies ME2, ME2-EA oder ME2-MDSA) wurde in einem Aliquot (3,5 μl) auf ein glimmentladenes Quantifoil R1.2/1.3-Lochkohlenstoffgitter (Quatifoil GmbH, Deutschland) aufgetragen. Nach einer Wartezeit von zehn Sekunden wurden die Gitter mit Filterpapier abgetupft und sofort in mit flüssigem Stickstoff gekühltes flüssiges Ethan getaucht. Die Gitter wurden 3,0 s lang mit einer Blotting-Kraft von 0 für den ME2-EA-Komplex (1 mg/ml) und den ME2-MDSA-Komplex (0,5 mg/ml) geblottet. Im Fall von ME2 (1 mg/ml) ohne Inhibitor wurde das Gitter 3,5 s lang mit einer Blotting-Kraft von 5 geblottet. Die Kryo-EM-Gitter wurden dann vitrifiziert und bis zur Bildgebung in flüssigem Stickstoff gelagert.

Zunächst wurden Kryo-EM-Gitter mit einem 200-kV-Transmissionselektronenmikroskop Talos Arctica untersucht, das mit einem Falcon III-Detektor (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ausgestattet war. Die Bilder wurden im linearen Modus mit einer Nennvergrößerung von 92.000 × aufgenommen, was einer Pixelgröße von 1,1 Å/Pixel und einer Defokussierungseinstellung von –3,0 μm entspricht. Geeignete Kryo-EM-Gitter wurden in flüssigem Stickstoff gelagert und wiederhergestellt, bis Daten mit dem Titan-Krios-Transmissionselektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gesammelt wurden. Der hochauflösende Datensatz wurde automatisch auf einem 300-kV-Titan-Krios (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) erfasst, der mit einer X-FEG-Elektronenquelle unter Verwendung der Software EPU-2.7.0 ausgestattet war. Für die ME2-EA- und ME2-MDSA-Komplexe wurden Daten mit einem K2 Summit-Detektor im Zählmodus (Pistolenlinse 4, Punktgröße 6, C2-Apertur 50 μm) gesammelt, der mit GIF-Bio-Quantum-Energiefiltern von Gatan ausgestattet war. Die Rohfilmstapel wurden mit einer nominellen Vergrößerung von 165.000-fach aufgenommen, was einer Pixelgröße von 0,82 Å/Pixel entspricht. Der Defokusbereich wurde auf –1,5 bis –2,25 μm eingestellt und die Spaltbreite der Energiefilter wurde auf 20 eV eingestellt. Sechzig Bilder von nicht verstärkungsnormalisierten TIFF-Stapeln wurden mit einer Dosisrate von ~11 e-/Å2 pro Sekunde und einer Gesamtbelichtungszeit von 4,5 s aufgezeichnet, was zu einer akkumulierten Dosis von ~50 e-/Å2 (~ 0,83 e-) führte. /Å2 pro Rahmen). Wie bei ME2 wurden die Daten mit dem K3 Summit-Detektor (ausgestattet mit GIF Bio-Quantum Energy Filters, Gatan) im Superauflösungsmodus (Pistolenlinse 4, Punktgröße 5, C2-Blende 50 μm) gesammelt. Die Rohfilmstapel wurden mit einer nominellen Vergrößerung von 81.000-fach aufgenommen, was einer Pixelgröße von 1,061 (Superauflösung 0,5305 Å/Pixel) entspricht. Der Defokusbereich wurde auf –1,5 bis –2,5 μm eingestellt und die Spaltbreite der Energiefilter wurde auf 20 eV eingestellt. Vierzig Bilder von nicht verstärkungsnormalisierten TIFF-Stapeln wurden mit einer Dosisrate von ~14 e-/Å2 pro Sekunde und einer Gesamtbelichtungszeit von 2,8 s aufgezeichnet, was zu einer akkumulierten Dosis von ~40 e-/Å2 (~ 1 e-) führte. /Å2 pro Rahmen). Die zur Erfassung von Kryo-EM-Daten verwendeten Parameter sind in der ergänzenden Tabelle S2 zusammengefasst.

Alle im Zählmodus erfassten ME2-EA- oder ME2-MDSA-Bildstapel wurden zur Bewegungskorrektur und Dosisgewichtung mit MotionCor246 mit einem 5 × 5-Patch ohne Binning in Relion importiert (was zu einer Pixelgröße von 0,82 Å/Pixel führte). MotionCor246 wurde zur Bewegungskorrektur und Dosisgewichtung der ME2-Bildstapel ohne Inhibitoren im Super-Resolution-Modus unter Verwendung eines 5 × 5-Patches und zweifacher Binning (was zu einer Pixelgröße von 0,83 Å/Pixel führte) verwendet. Die Kontrastübertragungsfunktion (CTF) wurde aus den Bildern mit CTFFIND4.1 nach Bewegungskorrektur und Dosisgewichtung47 berechnet. Alle Partikel wurden halbautomatisch mit cisTEM48 extrahiert, und die ausgewählten Partikelkoordinaten wurden dann zur Partikelextraktion mit einer Boxgröße von 384 Pixeln (für ME2-EA- und ME2-MDSA-Komplexe) und 256 Pixeln (für hemmstofffreie Komplexe) in Relion 3.049 importiert ME2). Mehrere Runden der 2D-Klassifizierung in Relion 3.049 wurden verwendet, um unbefriedigende 2D-Klassendurchschnitte zu eliminieren, gefolgt von der Partikelauswahl und -extraktion. Die in der letzten Runde der 2D-Klassifizierung klassifizierten Partikel wurden zur Erstellung von Ab-initio-Karten an cryoSPARC50 übertragen. Danach wurden die Ab-initio-Karten in Relion49 importiert und als Ausgangsreferenzen für die 3D-Klassifizierung (in 3 Klassen unterteilt) verwendet. Zur Verfeinerung der schönen 3D-Klassen wurde die automatische 3D-Verfeinerung mit D2-Symmetrie verwendet. Nach der CTF-Verfeinerung und dem Bayes'schen Polieren wurden die polierten glänzenden Partikel zur weiteren 2D-Klassifizierung und heterogenen 3D-Verfeinerung ohne Auferlegung einer Symmetrie in cryoSPARC50 importiert (C1). Nach homogener und ungleichmäßiger Verfeinerung mit D2-Symmetrie wurden Partikel, die zu den feinen 3D-Klassen gehörten, auf eine höhere Auflösung verfeinert. In cryoSPARC wurde die Karte geschärft und die Auflösung geschätzt50. Die Gesamtauflösung wurde mithilfe des Kriteriums Fourier Shell Correlation (FSC) = 0,143 bestimmt, während die lokale Auflösung ebenfalls mithilfe von cryoSPARC50 bestimmt wurde. UCSF Chimera wurde zur Visualisierung von 3D-Dichtekarten51 verwendet. Abbildung S2 fasst die Details der Kryo-EM-Rekonstruktion zusammen. Die Verfahren zur Verarbeitung von Einzelpartikelbildern sind in den Abbildungen zusammengefasst. S3–S5. Tabelle S2 fasst die statistischen Daten für Kryo-EM-Rekonstruktionen zusammen.

Um die Atommodelle für die Kryo-EM-Karten von inhibitorfreiem ME2 (2,72 Å), ME2-EA (2,72 Å) und ME2-MDSA (2,84 Å) zu erstellen, wurde die Atomstruktur von menschlichem ME2 (PDB-ID: 1QR6) erstellt. war fest in die Kryo-EM-Karten eingepasst. Die Konformationsunterschiede wurden manuell im COOT-Programm52 mithilfe der „Real Space Refinement Zone“-Funktionen im „Model/Fit/Refine“-Dienstprogramm mit den Einschränkungen „Torsion“, „Plannar Peptide“, „Trans Peptide“ und „Ramachandran“ angepasst . Anschließend wurde die PHENIX-Funktion „Real-Space Refinement“ verwendet, um das Atommodell53 weiter zu optimieren, das das eingegebene Atommodell, die Kryo-EM-Karte und das mithilfe des Goldstandards FSC geschätzte Auflösungsventil umfasste. Nach einer visuellen Inspektion des PHENIX-optimierten Atommodells in COOT wurden die problematischen Regionen und Ramachandran-Ausreißer mithilfe der „Real Space Refinement Zone“ manuell korrigiert. Zahlreiche Durchläufe der „Real-Space-Verfeinerung“ des Atommodells in COOT und PHENIX wurden durchgeführt, bis keine weitere Verbesserung erzielt wurde. Wir haben keine Reste mit fehlender Dichte an den N- und C-Termini modelliert. Der Anteil der Nicotinamid-Mononukleotid-Einheit (NMN) an der Elektronendichte von NAD+ ist schlecht aufgelöst, daher haben wir diesen Bereich hauptsächlich auf der Grundlage der Geometriebeschränkungen modelliert. Interessanterweise ist ein Teil der MDSA-Dichte in der Sharpen-Karte relativ verschwunden. Bei der MDSA-Modellierung geht ein Teil der MDSA-Dichte in der geschärften Karte verloren, kann aber in der ungeschärften Karte beobachtet werden (Abb. S16). Die Elektronendichte des halben MDSA-Moleküls, das der Bindungsstelle zugewandt ist, ist weniger genau definiert als die Elektronendichte des halben MDSA-Moleküls an der Bindungsstelle. Wir platzierten zunächst die Hälfte von MDSA in der Bindungsstelle basierend auf der genau definierten Dichte und die andere Hälfte basierend auf den chemischen Beschränkungen und der nachverfolgbaren Dichte aus der ungeformten Karte. Es ist erwähnenswert, dass die weniger gut definierte Dichte in der geschärften Karte verschwunden ist, was auf einen unterschiedlichen B-Faktor innerhalb von MDSA hindeutet, und dass der halbe B-Faktor, der nach außen zur Bindungsstelle zeigt, flexibler ist. Zur Validierung des Atommodells wurde die Funktion „Comprehensive validation (cryo-EM)“ von PHENIX genutzt. Tabelle S2 fasst die Validierungsstatistiken zusammen.

Menschliche embryonale Nieren-293-Zellen (HEK293T) wurden von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) erworben; Zwei menschliche fetale Lungenfibroblastenzellen (HFL-1 und MRC-5) und menschliche Brustadenokarzinomzellen (MCF-7) wurden vom Bioresource Collection and Research Center (BCRC, Hsinchu, Taiwan) erworben. Die humane nichtkleinzellige Lungenkrebszelllinie H1299 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) erworben. Die HEK293T-, HFL-1-, MRC-5- und MCF-7-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (HyCloneTM, Cytiva, Marlborough, MA, USA) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (FBS; Sigma, St. Louis) enthielt , MO, USA) und 1 % Penicillin/Streptomycin; Die H1299-Zelle wurde in RPMI (HyCloneTM, Cytiva, Marlborough, MA, USA) kultiviert, das 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt. Alle Zelllinien wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert.

Ungefähr 70 % konfluente HEK293T-Zellen (1 × 106 Zellen) auf einer 6-cm-Schale wurden mit pcDNA3.1-empty (Rückgratvektor) und pcDNA3.1-ME2 durch ein Transfektionsreagenz TransIT-X2® (Mirus Bio LLC, WI) transfiziert , USA) mit opti-MEMTM-Medium (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, Waltham, MA, USA) für 24 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Das pcDNA3.1-empty (Plasmid Nr. 52535) wurde von Addgene (Cambridge, MA, USA) gekauft und das pcDNA3.1-ME2 wurde durch Einfügen des ME2-Gens in den Vektor konstruiert. Zur Bestimmung des ME2-Expressionsniveaus in der Zelle wurde Immunblotting verwendet.

Das lentivirale Transfektionspartikel wurde verwendet, um den lentiviralen Vektor pLKO_005 mit kurzer Haarnadel-RNA (shRNA) zu transportieren. Die Kontrollvektoren pLKO-shCon (TRC2.Void, ASN0000000001) und pLKO-shME2 (TRCN0000294007) wurden von der National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taipei, Taiwan) erhalten und die Haarnadelsequenzen von shRNA waren wie folgt: shCon, 5′ -CCGGAGTTCAGTTACGATATCATGTCTCGAGACATTCGCGAGTAACTGAACTTTTTT-3′; shME2: 5′- CCGGAGTTCTTACAGAGCTACTAAACTCGAGTTTAGTAGCTCTGTAAGAACTTTTTTG-3′. Auf 6-Well-Platten wurden etwa 30 % konfluente HEK293T-Zellen (3 × 105 Zellen/Well) 48 Stunden lang mit einer lentiviralen Partikellösung bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 behandelt. Puromycin (3 μg/ml) wurde verwendet, um nicht transfizierte Zellen zu eliminieren. Mittels Immunblotting wurde das ME2-Expressionsniveau in der Zelle bestimmt.

Die Konzentrationen von zellulärem Pyruvat und NADPH wurden mit dem Pyruvate Colorimetric/Fluormetric Assay Kit bzw. dem PicoProbe™ NADPH Quantitation Fluorometrische Assay Kit (K609-100 und K349-100; BioVision, Milpitas, CA, USA) bestimmt. Auf 6-cm-Platten HEK293T (1,5 × 106 Zellen), MRC-5 (3 × 105 Zellen), HFL-1 (3 × 105 Zellen) und H1299 (3 × 105 Zellen) und MCF-7 (6 × 105 Zellen) wurden 24 Stunden lang in Medium mit 20 mM L-Malat bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden 48 Stunden lang mit EA oder MDSA behandelt. Nach der Ernte wurden die Zellen in 100 µL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) beschallt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand mit einer 10-kDa-Spin-Säule (Acrodisc®-Spritzenfilter, Pall Life Sciences) von Proteinen befreit und unter Verwendung von Arbeitsmischungen in einer 96-Well-Platte mit dem Biotek®-Multimode-Mikroplattenlesegerät analysiert, um Fluoreszenz bei Ex/Em zu erkennen =535/587 nm (Agilent, Santa Clara, CA, USA).

Die NAD+- und NADH-Spiegel wurden mit dem NAD/NADH-GloTM-Assay (G9071; Promega, Madison, WI, USA) bestimmt. Auf 6-cm-Platten wurden HEK293T (1,5 × 106 Zellen), HFL-1 (3 × 105 Zellen) und MRC-5 (3 × 105 Zellen) 48 Stunden lang mit 25 µM EA oder MDSA bei 37 °C mit 5 behandelt % CO2. HEK293T (2 × 106 Zellen in 100 µL PBS), HFL-1 und MRC-5 (2 × 105 Zellen in 100 µL PBS) wurden beschallt und die Überstände wurden unter Verwendung der 10 kDa Spin-Säule (Acrodisc® Spritzenfilter, Pall) deproteinisiert Biowissenschaften). Die Überstände (2 × 104 Zellen in 100 µL PBS) wurden mit einem gleichen Volumen an Nachweisreagenz in einer 96-Well-Platte gemischt und die Konzentrationen von NAD+ und NADH wurden mithilfe von Lumineszenzsignalen vom Biotek® Multimode-Mikroplattenlesegerät (Agilent, Santa Clara, Kalifornien, USA).

Auf 6-cm-Platten wurden HEK293T (1,5 × 106 Zellen), HFL-1 (3 × 105 Zellen) und MRC-5 (3 × 105 Zellen) mit 25 µM EA oder MDSA bei 37 °C mit 5 % CO2 für 48 behandelt H. H1299 (3 × 105 Zellen) und MCF-7 (6 × 105 Zellen) wurden 48 Stunden lang mit 150 µM EA oder MDSA bei 37 °C und 5 % CO2 behandelt. Der ATP-Gehalt der Zellen wurde mit einem CellTiter-Glo® 2.0 Cell Viability Assay (G9242; Promega, Madison, WI, USA) bestimmt. 2 × 104 Zellen wurden in 100 µL PBS resuspendiert und mit einem gleichen Volumen des Testpuffers umgesetzt. Die Lumineszenz wurde mit dem Multimode-Mikroplattenlesegerät Biotek® (Agilent, Santa Clara, CA, USA) nachgewiesen. Die intrazellulären ROS-Spiegel wurden mit einem ROS Detection Assay Kit (ab287839; Abcam, Cambridge, UK) bestimmt. 1,5 × 105 Zellen wurden 45 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln mit einem verdünnten ROS-Puffer inkubiert. Nach einem Waschvorgang mit PBS-Puffer wurden die Zellen in 150 µL ROS-Puffer resuspendiert und die Fluoreszenz bei Ex/Em=495/529 nm wurde mit dem Multimode-Mikroplattenlesegerät Biotek® (Agilent, Santa Clara, CA, USA) nachgewiesen. USA).

Die HEK293T-Zellen (3,75 × 104 Zellen), H1299 (1,75 × 104 Zellen) und MCF-7 (2,8 × 104 Zellen) wurden ausgesät und in Agilent Seahorse XF24 Zellkultur-Mikroplatten für 24 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. HEK293T-Zellen wurden dann 4 Stunden lang 0, 25 und 50 µM EA und MDSA ausgesetzt, während H1299- und MCF-7-Zellen 3 Stunden lang 0, 75 und 150 µM EA und MDSA ausgesetzt wurden. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C in einem Nicht-CO2-Inkubator wurde das Wachstumsmedium durch ein Basismedium (Agilent, Santa Clara, CA, USA) ersetzt, das 1 mM Pyruvat, 4 mM Glutamin und 1 mg/ml D enthielt -Glucose. Über einen Zeitraum von 24 Minuten wurden die Zellen nacheinander mit 5 µM Oligomycin A, 2 µM FCCP und 1 µM Ronstone/Antinomycin A behandelt. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) wurde mit einem Seahorse XFe24-Analysegerät in Verbindung mit dem Seahorse XF bestimmt Zell-Mito-Stresstest (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Die experimentellen Daten wurden mit dem Steuerungsprogramm Wave2.6 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) analysiert.

Die Reaktionsmischung für die ME2-Enzymaktivität bestand aus 10 mM MgCl2, 40 mM L-Malat und 2 mM NAD+ in 50 mM Tris-HCl (pH 7,4). Die K0,5,Malat- und Km,NAD-Werte wurden durch Titrieren einer Reihe von L-Malat- bzw. NAD+-Konzentrationen unter Beibehaltung gesättigter Konzentrationen anderer Verbindungen bestimmt. Ein UV/VIS-Spektrophotometer (Lambda 25, Perkin Elmer, MA, USA) wurde verwendet, um die Enzymaktivität zu überwachen, indem kontinuierlich der Anstieg von NADH verfolgt wurde, das bei 340 nm eine bemerkenswerte Absorption aufweist. Zur Bestimmung des Werts von Km,NAD wurde die Michaelis-Menten-Gleichung und zur Bestimmung des kcat-Werts der Extinktionskoeffizient von 6,22 mM−1 cm−1 verwendet. Zur Berechnung der Kooperativität von L-Malat wurde folgende Gleichung verwendet:

Dabei bezeichnet v die Anfangsgeschwindigkeit, Vmax die maximale Geschwindigkeit der Reaktion, K0,5 die Substratkonzentration bei halbmaximaler Geschwindigkeit und h den Hill-Koeffizienten, der den Grad der Kooperativität angibt. Zur Durchführung aller Berechnungen wurde Prism 8.0 verwendet (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Die Fumarataktivierung wurde durch Titrieren eines Bereichs von Fumaratkonzentrationen (0 bis 6 mM) unter Beibehaltung von 15 mM L-Malat, 1 mM NAD+ und 10 mM MgCl2 bestimmt.

Die Zellen wurden mit RIPA-Lysepuffer (Promega, Waltham, MA, USA) lysiert. Die Proteinkonzentration der Überstände wurde nach Homogenisierung und Zentrifugation mit der Bradford-Methode bestimmt. Die Überstände (50 μg) wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf die PVDF-Blotmembran übertragen. Das PVDF wurde mit Blockierungspuffer blockiert und 24 Stunden lang bei 4 °C mit maßgeschneiderten Anti-Human-ME2-Antikörpern (0,5 μg/ml) (MDbio Inc., Taipei, Taiwan) und Anti-Aktin-Antikörpern (1 μg/ml) inkubiert ( Arigo Biolaboratories, Hsinchu, Taiwan), gefolgt von einer Stunde bei 25 °C mit dem zweiten, mit Meerrettichperoxidase markierten Antikörper. Schließlich reagierten die markierten Antikörper mit verstärktem Chemilumineszenzpuffer und die Lumineszenz wurde mit einem ImageQuantTM LAS 4000 Mini-Imager (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) nachgewiesen.

Die relative Anzahl lebensfähiger Zellen in einer Population wurde mit dem CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay (G6080, Promega, Madison, WI, USA) bestimmt. Auf Platten mit 96 Vertiefungen wurden 1 × 104 Zellen ausgesät und 24 Stunden lang in 100 µL Medium inkubiert. Weitere 24 Stunden lang wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von EA und MDSA behandelt. Nachdem in jeder Vertiefung 50 µL Medium durch 50 µL Testreagenz ersetzt worden waren, wurden die Zellen 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Multimode-Mikroplattenlesegerät Biotek® bestimmt, das auf Ex/Em=490/505 nm eingestellt war (Agilent, Santa Clara, CA, USA).

Die Sekundärstruktur des ME2-Proteins wurde mit einem Zirkulardichroismus (CD)-Spektropolarimeter Jasco J-815 (Jasco Deutschland GmbH, Pfungstadt, Deutschland) bestimmt. Proteinproben (0,3 mg/ml) in 30 mM Tris-Acetat (pH 7,4) wurden mit einer Quarzküvette mit einer Schichtdicke von 0,1 cm nachgewiesen und CD-Spektrendaten wurden in 0,2-nm-Schritten zwischen 190 und 260 nm gesammelt. Jedes CD-Spektrum wurde anhand eines Durchschnitts aus zehn Einzelscans ermittelt und auf die Probenkonzentration normiert.

Etwa 70 % konfluente HEK293T-Zellen (3 × 106 Zellen) wurden 48 Stunden lang mit 50 µM EA und MDSA bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 behandelt. 4 ml 80 %iges (Vol./Vol.) Methanol wurden verwendet, um die Zellmetaboliten aus den Zellen zu extrahieren. Nach der Deproteinisierung mit der 10-kDa-Spin-Säule (Acrodisc®-Spritzenfilter, Pall Life Sciences) wurde die Konzentration der Extraktionslösung gegen die Konzentration von DNA oder Protein normalisiert. Die Metaboliten-Extraktionslösung wurde mit einem Stickstoffverdampfer eingedampft, um das Methanol zu entfernen, und in Acetonitril (ACN) bei einer Konzentration von 20 % (Vol./Vol.) resuspendiert. Die flüssigkeitschromatographischen Experimente wurden auf einem VanquishTM LC-System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt, das mit einer Cogent Diamond-HydrideTM-Säule (150 × 2,1 mm, 4 µm; MicroSolv Technology Corp., Eatontown, NJ, USA) ausgestattet war. . Die mobile Phase bestand aus (A) 0,01 % Ameisensäure und (B) Wasser/ACN 90:10 (Vol./Vol.). In dieser Studie wurde der folgende Gradient verwendet: 0–3 Min., 20–20 % A; 3–9,5 Min., 20–30 % A; 9,5–10 Min., 30–70 % A; 10–11 Min., 70–100 % A; 11–14 Min., 100–100 % A; 14–14,1 Min., 100–20 % A; 14,1–35 Min., 20–20 % A. Die Flussrate betrug 0,2 ml/Min. Die massenspektrometrischen Analysen wurden auf einem Thermo Fisher Scientific TSQ AltisTM Triple Quadrupol-Massenspektrometer (Waltham, MA, USA) durchgeführt, das mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) im Positiv-Scan-Modus unter Verwendung des ausgewählten Reaktionsüberwachungsmodus (SRM) ausgestattet war. Die optimalen Parameter waren wie folgt: Hüllgasdurchflussrate von 35 willkürlichen Einheiten, Hilfsgasdurchflussrate von 5 willkürlichen Einheiten, Kapillartemperatur von 325 °C und Sprühspannung von 3,5 kV.

H1299 (1,5 × 105 Zellen) und MCF-7 (3,0 × 105 Zellen) wurden in eine Costar® 24-Well-Platte (Corning, NY, USA) ausgesät und 24 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 kultiviert, um a zu bilden konfluente Zellmonoschicht. Nachdem die Zellen die Konfluenz erreicht hatten, wurde das Medium entfernt und PBS-Puffer zum Waschen der Zellen verwendet. Anschließend wurde die Monoschicht mit einer 200-µL-Pipettenspitze angekratzt und die Zellen 48 Stunden lang mit 150 µM EA oder MDSA bei 37 °C und 5 % CO2 behandelt. Mit einem automatisierten Lionheart FX-Mikroskop (BioTek®, Agilent, Santa Clara, CA, USA) wurden die Hellfeldbilder der Zellen aufgenommen und analysiert.

Matrigel® (Corning, NY, USA) wurde 24 Stunden lang in der oberen Kammer einer 24-Well-Transwell®-Platte (Corning, NY, USA) beschichtet (200 µg/ml Matrigel für MCF7, 1000 µg/ml Matrigel für H1299). . Matrigel wurde mit dem FBS-freien Medium verdünnt. Anschließend wurden H1299 (1,0 × 105 Zellen) und MCF7 (1,5 × 105 Zellen) in der oberen Kammer mit FBS-freiem Medium ausgesät und 24 Stunden lang mit 150 µM EA oder MDSA behandelt. In der Zwischenzeit wurde das Chemoattraktionsmedium mit 10 % FBS in die untere Kammer gegeben. Zur Aufnahme der Zellbilder wurde ein Umkehrmikroskop (Olympus Corporation, Tokio, Japan) verwendet, das dann mit Image J54 analysiert wurde.

Die dargestellten Daten bezeichnen Mittelwerte ± Standardabweichungen (Mittelwert ± SD). In diesen Fällen beträgt die Anzahl der biologisch unabhängigen Proben drei oder mehr. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des ungepaarten zweiseitigen Student-t-Tests oder der einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett-Test bei Signifikanzniveaus von *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < durchgeführt 0,001.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die hier ermittelten Kryo-EM-Strukturen sind in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) unter den Zugangscodes EMD-33145 (offene Form von ME2), EMD-33146 (ME2-EA-Komplex) und EMD-33147 (ME2-MDSA-Komplex) hinterlegt ). Die zugehörigen Molekülmodelle sind im PDB unter den Zugangscodes 7XDE (offene Form von ME2), 7XDF (ME2-EA-Komplex) und 7XDG (ME2-MDSA-Komplex) hinterlegt. Alle anderen während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel, den Zusatzdaten und den Zusatzinformationsdateien enthalten. Die im Rahmen dieser Studie generierten und analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Republik China (MOST 104-2311-B-005-009 -MY3, MOST 110-2311-B-005-007 und 108-2320-B-040-020-MY3) finanziell unterstützt ); teilweise unterstützt durch das Advanced Plant and Food Crop Biotechnology Center des Featured Areas Research Center Program im Rahmen des Higher Education Sprout Project des taiwanesischen Bildungsministeriums (MOE). Wir möchten uns für die Unterstützung bei der MS-Analyse durch das Instrument Center der National Chung Hsing University bedanken. Die Kryo-EM-Experimente wurden in der Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM) durchgeführt. ASCEM wird gemeinsam vom Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (Grant-Nr. AS-CFII-111-210) und dem Taiwan Protein Project (Grant-Nr. AS-KPQ-109-TPP2) unterstützt. Diese Arbeit nutzte die verteilten Cloud-Ressourcen des Academia Sinica Grid-Computing Center, die von der Academia Sinica unterstützt werden.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ju-Yi Hsieh, Kun-Chi Chen, Chun-Hsiung Wang.

Abteilung für Biowissenschaften, National Chung Hsing University, Taichung, 402, Taiwan ROC

Ju-Yi Hsieh, Kun-Chi Chen, Jie-An Ye, Yu-Tung Chou, Yi-Chun Lin, Cheng-Jhe Lyu, Rui-Ying Chang, Yi-Liang Liu und Hui-Chih Hung

Ph.D. Programm für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, National Chung Hsing University, Taichung, 402, Taiwan ROC

Kun-Chi Chen & Hui-Chi Hung

Institut für Biologische Chemie, Academia Sinica, Taipei, 115, Taiwan ROC

Chun-Hsiung Wang & Meng-Chiao Ho

Institut für Medizin, College of Medicine, Chung Shan Medical University, Taichung, 402, Taiwan ROC

Guang-Yaw Liu & Jie-An Ye

Instrument Center, Büro für Forschung und Entwicklung, National Chung Hsing University, Taichung, 40227, Taiwan ROC

Yen-Hsien Li

Fakultät für Chemie, National Chung Hsing University, Taichung, 402, Taiwan ROC

Yen-Hsien Lee & Mau-Rong Lee

Institut für Biochemische Wissenschaften, National Taiwan University, Taipei, 106, Taiwan ROC

Meng-Chiao Ho

Institut für Genomik und Bioinformatik, National Chung Hsing University, Taichung, 402, Taiwan ROC

Hui-Chih Hung

Advanced Plant and Food Crop Biotechnology Center, National Chung Hsing University, Taichung, 402, Taiwan ROC

Hui-Chih Hung

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JYH, CJL, RYC und YLL führten die kinetischen Experimente durch. CHW führte die Rohbauarbeiten durch. JYH, KCC, JAY, YTC und YCL führten die zellbasierten Studien durch. YHL und MRL führten die MASS-spektrometrische Analyse durch. JYH, CHW und KCC analysierten die Daten und halfen bei der Interpretation der Ergebnisse. HCH, MCH und GYL betreuten das Projekt gemeinsam und trugen zu seiner Gestaltung und Umsetzung sowie zu seiner Analyse und dem Verfassen von Papieren bei.

Korrespondenz mit Meng-Chiao Ho oder Hui-Chih Hung.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Azhar Rasul, Matthew J. Belousoff und Song Xiang für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Joao Valente.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hsieh, JY., Chen, KC., Wang, CH. et al. Die Unterdrückung des menschlichen Äpfelsäureenzyms 2 verändert den Energiestoffwechsel und hemmt die Zellatmung. Commun Biol 6, 548 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04930-y

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Eingegangen: 04. August 2022

Angenommen: 12. Mai 2023

Veröffentlicht: 22. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04930-y

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