Verschiedene, seltene mikrobielle Taxa reagierten auf die Tiefe des Deepwater Horizon

The ISME Journal Band 10, Seiten 400–415 (2016)Zitieren Sie diesen Artikel

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Das Ausblasen der Ölquelle Deepwater Horizon (DWH) erzeugte eine enorme Wolke dispergierter Kohlenwasserstoffe, die die mikrobielle Gemeinschaft der Tiefsee im Golf von Mexiko erheblich veränderte. Es wurde eine deutliche Anreicherung verschiedener mikrobieller Populationen beobachtet, allerdings ist wenig über die Häufigkeit und den Reichtum spezifischer mikrobieller Ökotypen bekannt, die am biologischen Abbau von Gas, Öl und Dispergiermitteln nach Ölverschmutzungen beteiligt sind. Hier dokumentieren wir eine bisher unerkannte Vielfalt eng verwandter Taxa, die zu Cycloclasticus, Colwellia und Oceanospirillaceae gehören, und beschreiben ihre räumlich-zeitliche Verteilung im Tiefwasser des Golfs, in unmittelbarer Nähe der Entladungsstelle und in zunehmender Entfernung von dieser, vor, während und nachher die Entladung. Eine hochempfindliche Rechenmethode (Oligotypisierung), die auf einen Datensatz angewendet wurde, der aus der 454-Tag-Pyrosequenzierung der bakteriellen 16S-ribosomalen RNA-Gen-V4–V6-Regionen generiert wurde, ermöglichte die Erkennung der Populationsdynamik auf der Ebene suboperativer taxonomischer Einheiten (0,2 % Sequenzähnlichkeit). ). Die biogeochemische Signatur der Tiefseeproben wurde anhand der Gesamtzellzahl, der Konzentration kurzkettiger Alkane (C1–C5), der Nährstoffe, des (farbigen) gelösten organischen und anorganischen Kohlenstoffs sowie der Methanoxidationsraten bewertet. Durch die statistische Analyse wurden Umweltfaktoren aufgeklärt, die die ökologisch relevante Dynamik von Oligotypen prägten, die wahrscheinlich unterschiedliche Ökotypen darstellen. Große Kohlenwasserstoffabbauanlagen, die an die langsam diffusive natürliche Kohlenwasserstoffversickerung im Golf von Mexiko angepasst waren, schienen den Bedingungen während der DWH-Katastrophe nicht gewachsen zu sein oder wurden verdrängt. Im Gegensatz dazu nahm die Häufigkeit vielfältiger, seltener Taxa rasch zu, was die Bedeutung spezialisierter Subpopulationen und potenzieller Ökotypen während massiver Tiefsee-Öleinleitungen und möglicherweise anderer großräumiger Störungen unterstreicht.

Nach der Explosion und dem Untergang der Offshore-Bohrplattform Deepwater Horizon (DWH) im Jahr 2010 wurden durch die größte Kohlenwasserstoffemission im offenen Ozean in der Geschichte beispiellose Mengen an Gas und Öl in die Tiefsee des nördlichen Golfs von Mexiko (im Folgenden als „Golf“ bezeichnet) freigesetzt Zu Beginn des DWH-Vorfalls, bevor das beschädigte Steigrohr durchtrennt wurde, kam es zu einer Kohlenwasserstoffinjektion in die Wassersäule in Form eines ausgeprägten Strahls, der aus dem kaputten Steigrohr austrat und die Tiefseechemie in der Nähe des Macondo-Bohrlochkopfes veränderte. Der in die Wassersäule aufsteigende Öl- und Gasstrahl riss kaltes Meerwasser mit sich (Johansen et al., 2001; Socolofsky et al., 2011) und erzeugte eine reichhaltige kohlenwasserstoffreiche Tiefseefahne, die südwestlich des Bohrlochs durch ihre Fluoreszenz erkannt wurde Signatur (Camilli et al., 2010; Diercks et al., 2010; Hazen et al., 2010) und Lichtstreuungsprofil (Diercks et al., 2010) sowie durch erhöhte Konzentrationen spezifischer Kohlenwasserstoffe (Camilli et al ., 2010; Diercks et al., 2010; Valentine et al., 2010; Joye et al., 2011; Kessler et al., 2011b; Reddy et al., 2012) und des Dispergiermittels Corexit (Kujawinski et al., 2012) 2011). Die Tiefwasserwolke erstreckte sich über Tiefen zwischen 1000 und 1300 m in einer Region von mindestens 35 km Länge und 2 km Breite (Camilli et al., 2010).

Zu Beginn der DWH-Ableitung beherbergten die mit Kohlenwasserstoffen belasteten Tiefseegewässer deutlich angereicherte Bakterienpopulationen im Zusammenhang mit Oceanospirillum, Cycloclasticus, Colwellia, Pseudoalteromonas, Rhodobacterales und Methylotrophen (Mason et al., 2012; Reddy et al., 2012; Redmond und Valentine). , 2012; Valentine et al., 2012). In-situ-Beobachtungen und Laborbefunde deuten darauf hin, dass diese Bakterien eine Schlüsselrolle beim biologischen Abbau von Öl in der Wolke spielten. Veränderungen in der Zusammensetzung der Kohlenwasserstoffhäufigkeit implizierten eine bevorzugte mikrobielle Nutzung von aus Öl gewonnenen kurzkettigen Alkanen mit höherem Molekulargewicht (Valentine et al., 2010; Kessler et al., 2011b), wohingegen lokale Anomalien des gelösten Sauerstoffs (Joye et al., 2011 ; Kessler et al., 2011a, 2011b) deuteten auf eine ausgedehnte aerobe Alkanatmung hin (Valentine et al., 2010; Crespo-Medina et al., 2014). Darüber hinaus identifizierten stabile Isotopenuntersuchungen und Einzelzellgenomik mikrobielle Populationen, die am Kohlenwasserstoffabbau oder der Anreicherung von Stoffwechselgenen beteiligt sind, die den Kohlenwasserstoffabbau in der Wolke steuern, wobei Colwellia wahrscheinlich Ethan und Propan oxidiert (Redmond und Valentine, 2012), Oceanospirillum Cyclohexan abbaut ( Mason et al., 2012) und Cycloclasticus unter Verwendung polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK) (Yakimov et al., 1998).

Beschreibungen mikrobieller Gemeinschaften unter Verwendung großer Datensätze von Markergenen in Kombination mit gut charakterisierten Umweltparametern bieten eine leistungsstarke Methode zur Bewertung der dynamischen Reaktionen von Bakteriengemeinschaften auf veränderte ökologische Bedingungen. Der übliche Ansatz für die Zuweisung von Taxonsequenzen für 16S-ribosomale RNA (rRNA)-Gensequenzen basiert typischerweise auf Schwellenwerten für die Sequenzähnlichkeit (z. B. 97 %), um operative taxonomische Einheiten (OTUs) zu identifizieren, mit dem Ziel, den Einfluss zufälliger Sequenzierungsfehler zu minimieren (Huse et al. , 2010; Kunin et al., 2010). Obwohl Verteilungsmuster von OTUs in Umweltproben häufig verwendet werden, um auf ökologische Funktionen mikrobieller Populationen zu schließen, erkennt dieser Ansatz keine kleinen Variationen in der 16S-rRNA-Gensequenz, die verschiedene Ökotypen widerspiegeln (Ward, 1998; Eren et al., 2013). Das Ökotyp-Konzept beschreibt eine Sammlung von Stämmen mit subtil unterschiedlichen genetischen Elementen, die es ermöglichen, leicht unterschiedliche ökologische Nischen zu besetzen und gleichzeitig die genetische Signatur und das (fast) volle ökophysiologische Potenzial zu bewahren (Konstantinidis und Tiedje, 2005). Die ökologische Besonderheit eng verwandter Populationen könnte beispielsweise durch Wachstum auf einem neuen Substrat oder durch metabolische Plastizität angezeigt werden, die beispielsweise je nach Umweltbedingungen mehrere Stoffwechselvorgänge durchführt (Konstantinidis et al., 2006). Eine solche metabolische Flexibilität war mit ziemlicher Sicherheit für verschiedene Taxa, die im Zuge der DWH-Katastrophe vorhanden waren, von Vorteil, da beispielsweise eng verwandte Colwellia-Ökotypen Ethan, Propan und Benzol oder seine Stoffwechselnebenprodukte oxidiert haben könnten (Redmond und Valentine, 2012).

Um umweltrelevante Unterschiede zwischen Sequenzen eng verwandter mikrobieller Taxa aufzulösen, die auf schwankende geochemische Bedingungen (z. B. Ökotypen) reagieren, sind bioinformatische Ansätze erforderlich, die eine Sub-OTU-Auflösung ermöglichen (Tikhonov et al., 2014). Die Oligotypisierung unterscheidet subtile Nukleotidvariationen innerhalb des 16S-rRNA-Gen-Amplikons. Die Ergebnisse zeigen, dass routinemäßige Clustering-Strategien zu einer einzigen OTU zusammenlaufen würden (Eren et al., 2013). Der ökologisch aussagekräftige Index der Shannon-Entropie ignoriert stochastische Variationen, beispielsweise Sequenzierungsfehler, und verwendet informationsreiche Standorte, um ähnliche Sequenzen in Oligotypen aufzuschlüsseln, die diskrete mikrobielle Populationen in Gemeinschaften darstellen, die aus verschiedenen ökologischen Kontexten beprobt wurden. Die Unähnlichkeitsschwellenwerte für Oligotypen können bei nur 0,2 % liegen, im Vergleich zu den üblicherweise verwendeten 3 %, die mithilfe von OTU-Clustering ermittelt werden.

In dieser Arbeit haben wir uns in einem noch nie dagewesenen Ausmaß mit der mikrobiellen Vielfalt der DWH-Tiefsee-Kohlenwasserstofffahne befasst. Wir berichten über ein unerkanntes Maß an Diversität zwischen wichtigen Mikroorganismen, die am Abbau von Kohlenwasserstoffen beteiligt sind, und beschreiben ihre räumlich-zeitliche Reaktion auf die Öl-, Gas- und Dispergiermittelinfusion in die Tiefsee des Golfs. Proben wurden vor, während und nach der Entladung, in unmittelbarer Nähe der Entladungsstelle und in zunehmender Entfernung von dieser entnommen (Tabelle 1). Wir untersuchten die mikrobielle Populationsdynamik eng verwandter Taxa durch Oligotypanalyse bakterieller 16S-rRNA-Gene. Die geochemische Signatur der Plume-Flüssigkeiten charakterisierte die Umweltfaktoren, die zu den beobachteten bemerkenswerten Verschiebungen in der relativen Häufigkeit eng verwandter mikrobieller Taxa führten, die wahrscheinlich unterschiedliche Ökotypen darstellen.

Proben wurden aus dem nördlichen Golf von Mexiko (Tabelle 1, ergänzende Abbildung S1) auf den Kreuzfahrten R/V Pelican (PE 10-20, März 2010), R/V Walton Smith (WS1010, Mai/Juni 2010), R/V entnommen. V Oceanus (OC468-2, September 2010), R/V Atlantis (AT18-2, November 2010), R/V Endeavour (EN496, Juli 2011), R/V Endeavour (EN510, Juni 2012) und R/V Falkor (FA006, November 2012). Der DWH-Bohrlochkopf befindet sich im Mississippi Canyon Block 252 (Breitengrad 28,7381, Längengrad -88,3659; im Folgenden MC252). Von der DWH-Ableitung betroffene Proben wurden innerhalb der Fahne (Wassertiefe von 1000 bis 1300 m), oberhalb der Fahne oder unterhalb der Fahne entnommen. Darüber hinaus haben wir verschiedene Standorte auf einer Fläche von etwa 105.000 km2 beprobt, um die Auswirkungen der Tiefwasserfahne abzuschätzen. Um die Identifizierung der Proben zu erleichtern, wurden die Proben nummeriert (1–20) und mit „PRE“, „DUR“ und „POST“ gekennzeichnet, um den Zeitpunkt der Probenahme im Verhältnis zur Verschüttung (vor, während und nach der Einleitung) anzugeben, gefolgt von der Nachverfolgung durch den Ort der Probenahme (angegeben durch die Pachtblocknummer des Standorts, wie vom Bureau of Ocean Energy Management definiert). Die Bezeichnungen der ursprünglichen Kreuzfahrtproben sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Proben wurden durch Unterschiede im Ausmaß der Gas- und Ölfreisetzung als Funktion der Probenahmezeit gekennzeichnet (Ergänzungstabelle S1). Eine einzigartige Probe wurde im November 2012 direkt im DWH-betroffenen Gebiet (19-POST-MC252) entnommen; Nach unserem besten Wissen ist dies die Probe, die dem bisher geborgenen Bohrlochkopf am nächsten liegt (die Entfernung zum Bohrlochkopf betrug 72 m). Eine weitere einzigartige Probe (20-POST-MC253) wurde aus einem neu entdeckten Sickerpunkt etwas östlich von MC252 gewonnen. Die Quelle dieses Lecks bleibt hypothetisch, könnte jedoch aus dem MC252-Reservoir stammen. Beide Proben (19-POST-MC252 und 20-POST-MC253) spiegeln wahrscheinlich eine Mischung aus pelagischen und benthischen Mikrobengemeinschaften wider, da das Meerwasser nahe der Sedimentoberfläche entnommen wurde und, basierend auf der visuellen Beobachtung während der Probenahme mit ferngesteuerten Fahrzeugen, etwas Sediment enthielt Partikel. Mithilfe von Zeitreihenproben zwischen März 2010 und November 2012 konnten wir das Ausmaß der Störung und Wiederherstellung der endemischen pelagischen Mikrobenpopulation durch das DWH-Ereignis abschätzen. Darüber hinaus wurden natürliche Kohlenwasserstoffaustrittsstellen im nördlichen Golf beprobt, um gas- und ölabbauende mikrobielle Hintergrundgemeinschaften aufzuklären, die in der Tiefwasserumgebung des Golfs vorherrschen.

Sickerstellen am Mississippi Canyon Block 118, im Folgenden als MC118 bezeichnet, liegen etwa 150 km südlich von Pascagoula, MS (mittlerer Breitengrad 28,8522, mittlerer Längengrad -88,4928) und 26 km nordnordwestlich von MC252 bei einer Wassertiefe von 900 M. Die Sickerstellen bei MC118 wurden durch die Tiefseefahne beeinträchtigt, wir haben an dieser Stelle jedoch einen Monat vor Beginn der DWH-Ölableitung, im März 2010, Proben genommen (1-PRE-MC118 und 2-PRE-MC118; Tabelle 1). Diese Proben von MC118 spiegelten die natürliche pelagische Hintergrundsickergemeinschaft wider, die in diesem Gebiet endemisch ist, wo sich die Tiefsee-Kohlenwasserstofffahne etwa 6–8 Wochen später auflöste. Im Allgemeinen sind MC118-Sickerstellen durch Erdgas- und Ölaustritt, chemosynthetische Gemeinschaften einschließlich Beggiatoa (Lloyd et al., 2010), Methaneiswürmer sowie chemosymbiotische Muscheln und Muscheln gekennzeichnet, was auf hohe Kohlenwasserstoffflüsse und hohe Hintergrundraten mikrobieller Aktivität hinweist ( Bowles et al. 2011).

Wie MC118 zeichnen sich Sickerstellen im Green-Canyon-Block 600, im Folgenden GC600, durch ausgedehnte Gas- und Ölsickerungen, Sickermakrofauna (einschließlich chemosymbiotischer Muscheln und Muscheln) sowie mikrobielle Matten, die die Sedimentoberfläche besiedeln, und zahlreiche Karbonataufschlüsse aus (Roberts et al., 2010). Das GC600-Gebiet liegt 260 km südwestlich von MC252 (mittlerer Breitengrad 27,3696, mittlerer Längengrad -90,5693) und wurde nicht direkt von der DWH-Tiefwasserfahne beeinflusst. Die am GC600 (17-POST-GC600 und 18-POST-GC600; Tabelle 1) entnommenen Proben repräsentieren natürliche pelagische Sickergemeinschaften nach der DWH-Öleinleitung (Juni und November 2012). GC600 ist eine der aktivsten natürlichen Ölquellen im Golf von Mexiko in einer Wassertiefe von 1250 m und wurde bereits ausführlich beschrieben (Joye et al., 2010; Roberts et al., 2010; Hu et al., 2012). .

Eine CTD-Rosette zur Messung von Leitfähigkeit (Salzgehalt), Temperatur, Tiefe, Chlorophyllfluoreszenz, Strahlübertragung sowie Ölfluoreszenz, ausgestattet mit zwölf 10-Liter- (R/Vs Walton Smith, Pelican) oder vierundzwanzig 20-Liter- (R/Vs Walton Smith, Pelican) Vs Oceanus, Atlantis, Endeavour, Falkor) Niskin-Flaschen wurden zum Sammeln von Wasserproben verwendet. Zusätzliche Wasserproben wurden mithilfe von 1-Liter-Niskin-Flaschen entnommen, die an einem ferngesteuerten Fahrzeug oder einem Mehrfachentkerner angebracht waren. Nach der Bergung der Rosette oder einzelner Niskin-Flaschen (ferngesteuertes Fahrzeug/Mehrfachentkerner) wurden Wasserproben gesammelt, indem ein Abschnitt eines sauberen (mit Säure gespülten, mit Milli-Q gespülten und getrockneten) Silikonschlauchs an den Anschluss angeschlossen und das Wasser in a abgelassen wurde vorgereinigte (HCl-getränkte, MQ-gespülte und getrocknete) Flasche. Vor dem Befüllen wurden die Flaschen dreimal probeweise gespült. Im Labor wurden Teilproben für Zellzahlen, molekulare Analysen und Geochemie gesammelt. Zellzahlproben wurden mit Formalin (Endkonzentration 4 %) fixiert und bis zur Analyse bei –20 ° C gelagert. Für die molekulare Analyse wurden die Zellen konzentriert, indem 1 Liter Meerwasser mithilfe einer Schlauchpumpe durch einen Sterivex-Filter filtriert wurde. Die Filter wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur DNA-Extraktion bei –80 ° C gelagert. Mit Ausnahme der CH4/kurzkettigen Alkan-Unterproben wurden geochemische Proben mit einer Spritze aus der Flasche entnommen, dann durch einen 0,2-μm-Filter (Gelman Acrodisk oder Target Cellulose) geleitet und anschließend aliquotiert und für verschiedene Analysen fixiert (siehe Geochemie). Abschnitt). Alle geochemischen Probenfläschchen wurden vor der Verwendung mit Säure gewaschen, mit Reinstwasser gespült und bei 500 °C verbrannt.

Der pH-Wert der Probe wurde sofort mit einem hochohmigen Elektrometer bestimmt, das mit zertifizierten Standards kalibriert war. Für die Analyse der Ammoniumkonzentration (NH4+) wurde 1 ml einer 0,2 μm gefilterten Probe mit 200 μl Phenolreagenz konserviert; Die fixierte Probe wurde bei 4 °C gelagert und innerhalb von 1–2 Tagen mit der kolorimetrischen Indophenol-Methode analysiert (Solorzano, 1969). Proben für Nährstoffe ((NOx−=Nitrat (NO3−)+Nitrit (NO2−), Nitrit (NO2−) und Phosphat (PO43−)) und gelösten organischen Kohlenstoff wurden durch einen 0,2-μm-Filter in saubere Nalgene-Flaschen geleitet und bei eingefroren −20 °C bis zur Analyse, wie zuvor beschrieben (Joye et al., 2004). Der gelöste organische Kohlenstoff wurde mit einem Shimadzu-Analysator für den gesamten organischen Kohlenstoff (TOC-V; Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) auf angesäuertem (pH <2) gemessen. Proben nach 15-minütiger Begasung mit CO2-freier Luft. Filter- (Gelman Acrodisk- und Target-Zellulosefilter) Blindproben (durch die Filter geleitetes MilliQ-Wasser) für gelöste organische Stoffe wurden parallel durchgeführt und erwiesen sich als unbedeutend.

Zur Quantifizierung von Methan oder kurzkettigen Alkanen (Ethan, Propan, Butan und Pentan) wurden Gase entweder durch Kopfraumextraktion (R/Vs Pelican, Walton Smith Kreuzfahrten) oder aus einer 750 ml Wasserprobe mittels Vakuumbeschallung (alle anderen) gewonnen Kreuzfahrten) (Crespo-Medina et al., 2014). Das Volumen des gewonnenen Gases wurde aufgezeichnet und die Gasprobe quantitativ in ein Serumfläschchen überführt; Alkane wurden später mittels Gaschromatographie quantifiziert. Zur Analyse von gelöstem anorganischem Kohlenstoff wurde 1 ml einer 0,2 μm gefilterten Probe in ein mit Helium gespültes und mit Bördelverschluss verschlossenes 6-ml-Headspace-Fläschchen injiziert, das dann mit 0,1 ml konzentrierter Phosphorsäure angesäuert wurde. Methan oder kurzkettige Alkane (Methan, Ethan, Propan, Butan und Pentan) und gelöster anorganischer Kohlenstoff wurden auf einem Gaschromatographen gemessen, der mit einem Flammenionisationsdetektor (Shimadzu GC 14A mit einer 0,5 m Haysep DB-Vorsäule und einer 2 m langen Haysep DB-Vorsäule) ausgestattet war Carbosphere-Säule (Alltech Instruments, Deerfield, IL, USA) und ein Methanisierer (Shimadzu) zur Umwandlung von Kohlendioxid in Methan zur präzisen Quantifizierung. Die Isotopenzusammensetzung des gelösten anorganischen Kohlenstoffs wurde mit einem Picarro iCO2 Cavity-Ring-Down-Spektroskopiesystem mit einer Genauigkeit von 0,5‰ bestimmt. Farbige gelöste organische Stoffe, ein guter Indikator für gelöstes Öl (Diercks et al., 2010), wurden mit einem am Rosettenrahmen montierten WetLabs ECO-FL-Fluorometer (Philomath, OR, USA) quantifiziert.

Die Methanoxidationsraten wurden mithilfe einer tritiierten (3H) CH4-Radiotracer-Technik gemessen (Carini et al., 2005, Crespo-Medina et al. 2014). Für jede beprobte Tiefe wurden Meerwasserproben (dreifache (n=3) lebende Proben und eine abgetötete Kontrolle) mit einem an einer Spritze befestigten Tygon-Schlauch gesammelt und von unten nach oben ohne Luftblasen in 7-ml-Glasszintillationsfläschchen gefüllt, die ein Überlaufen ermöglichten der Probe, um das Fläschchen ohne Headspace zu füllen. Den Kontrollproben wurden sofort 500 μl Ethanol (96 %) zugesetzt, um die mikrobielle Aktivität zu stoppen. Die Fläschchen wurden sofort mit blasenfreien Butylkautschuksepten verschlossen, die mit einem Schraubdeckel gesichert waren; Die Proben wurden bis zur Tracer-Injektion (normalerweise innerhalb von 12–36 Stunden) bei 4 °C gelagert. In einigen Fällen war eine Lagerung über einen längeren Zeitraum vor der Bestimmung der Rate erforderlich (z. B. auf Kreuzfahrten ohne Transporter zur Radioisotopenisolierung); Wir fanden heraus, dass eine Lagerung von bis zu mehreren Wochen die Methanoxidationsraten nicht veränderte (siehe Nachtrag zu Crespo-Medina et al. 2014). Ein 100-μl-Aliquot der C3H4-Tracerlösung wurde mit einer gasdichten Spritze durch die Butylsepten in jede Probe injiziert, was eine Traceraktivität von ~75.000 dpm pro ml−1 Probe ergab. Die Proben wurden 48 Stunden lang bei In-situ-Temperatur im Dunkeln inkubiert. Die Inkubationen wurden durch Versetzen der Proben mit 200 μl Ethanol beendet, was dazu diente, die biologische Aktivität zu stoppen. Markiertes C3H4 wurde entfernt, indem die Probe mindestens 25 Minuten lang mit hydratisierter Luft gespült wurde. Szintillationscocktail (Scintiverse BD, Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) wurde hinzugefügt und die Proben wurden unter Verwendung eines Beckman 6500-Flüssigkeitsszintillationszählers (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) auf 3H2O-Aktivität gezählt. Die Geschwindigkeitskonstanten der Methanoxidation (k) wurden gemäß berechnet

(wobei A=Aktivität und t=Zeit) und mit der In-situ-CH4-Konzentration multipliziert, um die Methanoxidationsraten zu bestimmen.

Die Gesamtzahl der einzelnen Zellen wurde mittels Epifluoreszenzmikroskopie nach Anfärbung mit Acridinorange (AODC) gemäß Standardmethoden ermittelt (Hobbie et al., 1977). Die DNA-Extraktion wurde aus dem gesamten Sterivex-Filter (siehe Abschnitt „Probensammlung“) unter Verwendung des Gentra Puregene Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) wie zuvor beschrieben (Sinigalliano et al., 2007) in Kombination mit einer lytischen Enzymlösung (Qiagen) durchgeführt ; Zettler, 2013). DNA-Extrakte wurden bis zur PCR-Amplifikation bei –80 °C gelagert. Die Regionen V3–V5 und V4–V6 des 16S-rRNA-Gens wurden mit Tag-Pyrosequenzierung analysiert (Thor Marteinsson et al., 2013). Wir haben die Qualitätskontrolle und das Trimmen der Sequenzablesungen wie zuvor beschrieben durchgeführt (Huse et al., 2010) und eine Taxonomie mithilfe von Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST; Huse et al., 2008) und einem vom Marine Biological Laboratory (MBL) kuratierten SILVA zugewiesen Datenbankversion 108 (Quast et al., 2013). Die Spuren wurden an das Sequenzlesearchiv übermittelt und sind unter der Bioprojekt-ID PRJNA234441 verfügbar.

Alle Sequenzen wurden ankerbeschnitten, um Sequenzierungsfehlerartefakte zu minimieren. Um dies zu erreichen, wurden V3V5- und V6V4-Lesevorgänge (Ergänzungstabelle S2) auf einen konservierten Bereich (Leselänge von 371 bzw. 362 Basenpaaren) gekürzt. Anschließend verwendeten wir UCLUST (Edgar, 2010), um die Sequenzen basierend auf einem Ähnlichkeitsschwellenwert von 97 % in OTUs zu gruppieren (Ergänzungstabelle S3). Repräsentative Sequenzen aus jedem Cluster wurden ausgewählt und die Taxonomie wurde mit GAST zugewiesen (Huse et al., 2008).

Zur Bestimmung der Diversitätsindizes (Good's Coverage, Shannon's Index, Richness, Evenness, Inverse Simpson) und Morisita-Horn-Indizes verwendeten wir R (R-Core-Team, 2012) und das vegane Paket (Oksanen et al., 2013; Ergänzungstabelle). S4). Zwei Proben hatten wesentlich niedrigere Lesezahlen (6-DUR-MC335, 8217 Lesevorgänge und 17-POST-GC600, 84 Lesevorgänge) als alle anderen Proben (>21.500 Lesevorgänge) und waren daher nicht verdünnt. Die Verdünnung für alle anderen Proben wurde 100-mal berechnet, wodurch 100 OTU-Tabellen erstellt wurden, die gemittelt wurden, um die mittlere Verdünnungsbeobachtung jeder OTU in jeder Probe darzustellen. Mann-Whitney-Wilcoxon-Analysen bestätigten, dass sich die verdünnten Daten statistisch nicht von den nicht verdünnten Daten unterschieden (P = 0,8252). Alpha-Diversitätsindizes wurden für die nicht verdünnte OTU-Tabelle, eine zufällig verdünnte OTU-Tabelle und die gemittelte (100 Berechnungen) verdünnte OTU-Tabelle berechnet. Die Diversitätsschätzungen (Ergänzungstabelle S4) änderten sich zwischen den nicht-seltenen und den seltenen OTU-Tabellen nur geringfügig. Um Informationen für die Oligotypisierung beizubehalten, fuhren wir mit der nicht seltenen OTU-Tabelle fort. Wir haben Sequenzbeobachtungen in relative Häufigkeitsdaten umgewandelt, skaliert von 0 bis 100 % der Gemeinschaft, und Morisita-Horn-Beta-Diversitätsindizes wurden für alle OTUs und alle Oligotypen (siehe unten) sowie für Colwellia, Oceaniserpentilla, Cycloclasticus und SAR11 berechnet Oligotypen, separat.

Für phylogenetische Analysen verwendeten wir das ARB-Softwarepaket (Ludwig et al., 2004) mit der Datenbank SSURef111 von ARB SILVA (Pruesse et al., 2007). Phylogenetische Bäume von 16S-rRNA-Gensequenzen nahezu voller Länge wurden durch Maximum-Likelihood-Analyse berechnet und Oligotypsequenzen wurden anschließend nach Sparsamkeitskriterien in den Baum eingefügt, ohne dass Änderungen in der gesamten Baumtopologie möglich waren.

Wir verwendeten Oligotypisierung (Eren et al., 2013), um V6V4-Sequenzen zu bewerten, die den Gattungen Colwellia (26.217 Sequenzen), Oceaniserpentilla (168.045 Sequenzen) und Cycloclasticus (41.714 Sequenzen) zugeordnet sind, sowie auf dem SAR11 (64.701 Sequenzen) am Nukleotid Ebene. Diese Mikrobengruppen waren allgegenwärtig und über die Zeitreihe weit verbreitet, und Colwellia, Oceaniserpentilla und Cycloclasticus sind wichtige Mitglieder der ölabbauenden Mikrobengruppe, was sie zu idealen Kandidaten für die Untersuchung der Mikrodiversität mittels Oligotypisierung macht.

Alle in den Proben beobachteten Sequenzen, die sich in jede interessierende Gattung auflösten, wurden extrahiert, an einer Vorlage ausgerichtet, die aus den 16S-rRNA-Sequenzen voller Länge dieser Zielgattung bestand, und auf eine konsistente Start- und Endposition getrimmt. Die Entropie an jeder Nukleotidposition wurde berechnet und zwischen 13 und 19 informationsreiche Positionen trugen zur Oligotypisierung bei. Die Sequenzierung verlief von der V6- in die V4-Region, wobei der Fehler entlang der Länge des Lesevorgangs zunahm (> 450 bp). Daher beschränkten wir die interessierenden Orte mit hoher Entropie auf die Bereiche mit dem geringsten Rauschen in den Regionen V6, V5 und am Ende von V4 . Wir haben Oligotypen beibehalten, die in mindestens 10 % der Proben beobachtet wurden, in denen die Gattung vorkam, in mindestens einer Probe 0,1 % oder mehr häufig vorkamen und bei denen die häufigste eindeutige Sequenz 0,05 % aller Ablesungen in dieser Gattung ausmachte. Ein detailliertes Beispiel des Oligotypisierungsverfahrens ist in den ergänzenden Materialien beschrieben.

Wie beim vollständigen OTU-Datensatz verglichen wir die Auswirkungen der Verdünnung der resultierenden Oligotyp-Häufigkeitstabelle. Die Verdünnung der Tabelle auf die niedrigste Lesezahl einer Stichprobe (32, für 17-POST-GC600) erzeugte ein statistisch anderes Profil (MWW, P<0,01). Die Verdünnung auf die nächstniedrigere Tiefe (2856, 1-PRE-MC118) unterschied sich statistisch nicht vom vollständigen Oligotyp-Gemeinschaftsprofil (MWW, P = 0,5101) und verwarf 80 % der Oligotyp-Sequenzen. Korrelationstests zwischen Umweltparametern und verdünnten Daten ergaben mehr als doppelt so viele Beziehungen wie Analysen mit nicht verdünnten Oligotyphäufigkeiten (Daten nicht gezeigt). Um das Risiko falsch positiver Ergebnisse zu verringern, haben wir die verdünnten Daten nicht in der Oligotypisierungsanalyse verwendet.

Wir haben Beziehungen zwischen gemessenen Umweltparametern und Oligotyphäufigkeiten mithilfe von R (R-Core-Team, 2012), veganen Paketen (Oksanen et al., 2013) und Q-Wert (Klaus und Strimmer, 2012) bewertet. Der nichtparametrische Rangkorrelationskoeffizient ρ nach Spearman wurde für jede Oligotypverteilung und jeden Umgebungsparameter berechnet. Storeys Korrektur der Falscherkennungsrate für mehrere Tests bei q<0,05 wurde verwendet, um signifikante (P<0,05) Korrelationen beizubehalten.

Im Golf erhält das langsame und diffuse natürliche Aussickern von Gas und Rohöl vom Meeresboden (Behrens, 1988; Kennicutt II et al., 1988; Aharon, 1994) aktive Kohlenwasserstoff abbauende mikrobielle Gemeinschaften wie sulfatreduzierende und methanabbauende Mikroorganismen aufrecht. oxidierende Bakterien (Orcutt et al., 2010; Kleindienst et al., 2012). Im auffälligen Gegensatz zu den langsamen Erdgas- und Öleinträgen wurden durch die DWH-Ölableitung 2,6–3,6 × 105 t Gas und 5,9–8,4 × 105 t Öl freigesetzt (Joye et al., 2011; McNutt et al., 2012), was die Die mikrobiellen Populationen im Golf führen zu lokal beispiellosen Kohlenwasserstoffbelastungen. Die zeitlichen Auswirkungen der Tiefwasserfahne auf die einheimischen Bakteriengemeinschaften wurden zwischen März 2010 und November 2012 unter Bedingungen untersucht, die im Folgenden als „Pre-Discharge“ (PRE), „Discharge“ (DUR) und „Post-Discharge“ (POST) bezeichnet werden. Biogeochemische und hydrografische Daten (Ergänzungstabelle S1) definierten den Kern der Wolke. „Plume-Proben“ wiesen Methankonzentrationen >10 μM und/oder Wassertiefen zwischen 1000 und 1300 m (während der Entladung) auf, wohingegen „Nicht-Plume-Proben“ niedrigere Methankonzentrationen aufwiesen, aber immer noch Hinweise auf Auswirkungen durch die DWH-Ölentladung (Methan) aufwiesen Konzentrationen >10 nM aber <10 μM und Wassertiefen über 1000 m oder unter 1300 m). Um Plume-Populationen mit einheimischen ölabbauenden Bakteriengemeinschaften zu vergleichen, haben wir Tiefwasserproben aus zwei natürlichen Kohlenwasserstoffquellen, MC118 und GC600, entnommen (Orcutt et al., 2005; Bowles et al., 2011).

Unsere Probenstandorte liegen südwestlich des Bohrlochkopfes. Die Ausbreitung der Tiefwasserwolke nach Südwesten steht im Einklang mit der Strömung gegen den Uhrzeigersinn, die zur mittleren Zirkulation des nördlichen Golfs entlang des Kontinentalhangs beiträgt. Allerdings werden in der Region durch Instabilitäten der mittleren Strömung im Zusammenspiel mit der komplexen Bathymetrie kontinuierlich zyklonale und antizyklonale Wirbel mit einem Durchmesser von bis zu 40 km erzeugt (Cardona und Bracco, 2015), und sie haben die Wolke möglicherweise in andere Richtungen bewegt auch zumindest sporadisch. Numerische Integrationen mit einem regionalen Ozeanmodell legten nahe, dass sich das Muster und die Richtung der Wolke mit der Zeit änderten und sich nach einer etwa einwöchigen Ausbreitung nach Nordosten nach Südwesten verlagerten, so dass Wasserpakete in der Wolke mehrmals mit der Kohlenwasserstoffquelle in Kontakt kamen (Valentine et al., 2012). Aufgrund der chaotischen Natur der Zirkulation um den Bohrlochkopf ist es nicht möglich zu berechnen, wie lange es gedauert hat, bis sich die mikrobielle Gemeinschaft verändert hat, oder zu bewerten, wie oft Wasser in unmittelbarer Nähe des Bohrlochkopfs (d. h. im Umkreis von 5 km) mit dem austretenden Kohlenwasserstoffstrahl in Kontakt kam. Es ist jedoch klar, dass das Wasser, das wir im Mai/Juni 2010 beprobt haben, direkt durch den austretenden Kohlenwasserstoffstrahl beeinträchtigt wurde, und die Nachwirkungen dieser Belastung waren in Proben deutlich zu erkennen, die lange nach dem Zeitpunkt der Verschlusskappe des Bohrlochs (Juli 2010) entnommen wurden.

Die mikrobielle Gemeinschaft wurde anhand einer 454-Tag-Pyrosequenzierung der V3V5- und V6V4-Regionen des 16S-rRNA-Gens analysiert (Ergänzungstabelle S2). Ein Vergleich der taxonomischen Identifizierungen unter Verwendung dieser beiden Regionen zeigte, dass die Auswahl der variablen Region die Anzahl der berechneten OTUs beeinflusste, obwohl für V3V5 und V6V4 unabhängig von der Wahl der sequenzierten Region die gleichen allgemeinen Trends für kleinere und dominante Populationen beobachtet wurden (Ergänzung). Tabelle S3). Da die V6V4-basierte Sequenzierung einen umfassenderen Datensatz lieferte, wurde dieser anschließend für eine eingehende Analyse ausgewählt.

Morisita-Horn-Indizes, die auf der relativen Häufigkeit aller OTUs basieren, wurden verwendet, um Unterschiede in der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen den Proben zu messen. Die Wasserprobe, die wir während der Entladung am nächstgelegenen Punkt zum Bohrlochkopf entnommen haben – <0,5 km entfernt – spiegelte eine mikrobielle Gemeinschaft mit erheblichen Anzeichen einer Veränderung wider (11-DUR-MC252, 10-DUR-MC252, 12-DUR-MC25 und 9). -DUR-MC252; Abbildung 1) im Vergleich zur Hintergrundgemeinschaft (1-PRE-MC118 und 2-PRE-MC118; Morisita-Horn-Index 0,2–1; Abbildung 1a). Drei der Proben in der Nähe des DWH-Standorts (11-DUR-MC252, 10-DUR-MC252 und 12-DUR-MC252) unterschieden sich auch von der stromabwärts gelegenen, d. Morisita-Horn-Index 0,1–0,9; Abbildung 1a). Ein Vergleich von Proben an denselben Orten, aber unterschiedlichen Tiefen zeigte, dass die Wolke vertikal auf eine Schicht beschränkt war, deren Mitte knapp unter 1000 m in der Nähe der DWH-Austrittsstelle lag, und dass sie sich über eine größere Tiefe verteilte, als sie in tiefere Gewässer im Südwesten vordrang. Infolgedessen ähnelt die mikrobielle Gemeinschaft im Kern der Wolke in der Nähe des Bohrlochkopfs (9-DUR-MC252) den Populationen in anderen Proben der Wolke, obwohl die Gewässer bei Block 335 mindestens drei Tage voneinander entfernt sind (6-DUR-MC252). MC335) aus dem Abflussbrunnen unter Verwendung von Schätzungen der horizontalen Geschwindigkeit aus (Camilli et al., 2010) und dass unsere Proben stromabwärts und in der Nähe des Brunnens im Abstand von 2 Tagen und in umgekehrter Chronologie – bezogen auf die Fließrichtung – entnommen wurden.

Heatmaps, die die Unähnlichkeit mikrobieller Gemeinschaften in der Tiefsee aus Proben veranschaulichen, die vor, während und nach der DWH-Einleitung gewonnen wurden, basierend auf OTUs (a) und Oligotypen (Oceaniserpentilla, Cycloclasticus, Colwellia und SAR11; b). Von DWH betroffene Standorte wurden mit natürlichen Kohlenwasserstoffsickern im Golf von Mexiko, MC118 (1-PRE-MC118 und 2-PRE-MC118) und GC600 (17-POST-GC600 und 18-POST-GC600), verglichen. Unähnlichkeitsmaße von 0 bis 1 (farbcodiert als Blau – Weiß – Rot) wurden mithilfe des Morisita-Horn-Index berechnet.

In Übereinstimmung mit früheren Studien (Hazen et al., 2010; Redmond und Valentine, 2012; Valentine et al., 2012) beobachteten wir beim Vergleich aller OTUs unter den Proben signifikante Verschiebungen in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in Proben aus Fahnen im Vergleich zu Proben ohne Fahnen verringerte Diversität innerhalb der Wolke. Beispielsweise gruppierten sich Sequenzen aus Proben vor der Entladung in 811 und 980 bakterielle OTUs (1-PRE-MC118 bzw. 2-PRE-MC118), wohingegen von der Wolke betroffene Bereiche (7-DUR-MC295, 9-DUR-MC252, 8-DUR-MC295 und 6-DUR-MC335) wiesen eine geringere Anzahl bakterieller OTUs auf (199–548; Ergänzungstabelle S3). Auf Kosten des Gesamtreichtums der Gemeinschaft führte die DWH-Fahne zu einer Anreicherung bestimmter Mikrobenpopulationen und einer Verringerung der Mikrobenvielfalt. Obwohl bestimmte Organismen und/oder Populationen möglicherweise unter Plume-Bedingungen gediehen, wie z. B. hohe Konzentrationen an kurzkettigen Alkanen (Joye et al., 2011; Ergänzungstabelle S1), längeren Alkanen, PAK (Reddy et al., 2012) und Dioctylnatrium Sulfosuccinat (Kujawinski et al., 2011) zeigten andere Bestandteile der mikrobiellen Population eine verringerte Häufigkeit, fielen unter die Nachweisgrenze oder wurden möglicherweise inaktiv und/oder starben sowohl am Bohrlochkopf als auch stromabwärts davon. Im Gegensatz dazu wurde die höchste Anzahl bakterieller OTUs in Proben nach der Entladung aus einer produktiven natürlichen Methanfahne am Sickerpunkt, GC600 (18-POST-GC600; 1640 OTUs), beobachtet. Die 2012 aus dem Bohrlochkopfbereich entnommenen Proben wurden wahrscheinlich durch pelagische und benthische Mikroorganismen beeinflusst, da die Sedimente während der Grundwasserprobenahme leicht gestört wurden (19-POST-MC252 und 20-POST-MC253, 2997 bzw. 6835 OTUs).

Actinobakterien, Bacteroidetes, Chloroflexi, Deferribacteres, SAR11, SAR324 und SAR86 dominierten die Proben vor der Entlassung (1-PRE-MC118 und 2-PRE-MC118; Abbildung 2). Diese Gruppen werden typischerweise in pelagischen Meeresgewässern beobachtet (Swan et al., 2011). Während der DWH-Ölableitung im Mai und Juni 2010 stiegen die Zellzahlen in Fahnenproben um eine Größenordnung im Vergleich zum Hintergrund-Tiefseewasser (bis zu 2 × 106 Zellen ml–1 von 1–2 × 105 Zellen ml–1; Ergänzung). Tabelle S1), die auf erhöhte Wachstumsraten aufgrund der Infusion von Gas und Öl schließen lässt. Zu diesem Zeitpunkt machten Gammaproteobakterien 43–98 % aller Sequenzen in Fahnenproben aus (Abbildung 2, Ergänzungstabelle S3), gegenüber bescheideneren 23–29 % aller Sequenzen in Proben vor der Entladung. Gammaproteobakterien, die mit den Kohlenwasserstoffabbauern von Oceaniserpentilla (früher als DWH Oceanospirillum bezeichnet, z. B. Hazen et al., 2010; Redmond und Valentine, 2012), Colwellia oder Cycloclasticus assoziiert sind, machten bis zu 94 % aus (Oceaniserpentilla; 8-DUR-MC295). 35 % (Colwellia; 6-DUR-MC335) und 47 % (Cycloclasticus; 5-DUR-MC250 und 6-DUR-MC335) aller Bakteriensequenzen in Entladungsproben.

Relative Häufigkeit von Bakterienpopulationen über die gesamte Zeitreihe (vor der Entladung, während der Ölentladung und nach der Entladung), entlang eines vertikalen Transekts durch verschiedene Wassertiefen (603–1564 m) und an zwei natürlichen Kohlenwasserstoffsickern, MC118 (1-PRE-MC118). und 2-PRE-MC118) und GC600 (17-POST-GC600 und 18-POST-GC600). Bakteriengemeinschaften wurden mittels 454-Pyrosequenzierung der V6V4-Region des bakteriellen 16S-rRNA-Gens analysiert. Die Probenahmedaten, die spezifische Wassertiefe und die Standorte sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Im September 2010 waren die biogeochemischen Signaturen der Tiefwasserwolke weitgehend abgeschwächt (zum Beispiel betrugen die Methankonzentrationen ~1 nM in der Nähe des Bohrlochkopfes; Ergänzungstabelle S1; Crespo-Medina et al., 2014). Zu diesem Zeitpunkt waren methylotrophe Bakterien der Gattung Methylophaga, die in der Probe vor der Entlassung nicht nachweisbar waren, angereichert und machten 7 % aller Sequenzen aus (14-POST-MC422; Abbildung 2). Interessanterweise wurden Methylophaga auch in einer Probe von GC600 (1–2 % aller Sequenzen, 17-POST-GC600; Abbildung 2) und in zwei Proben nachgewiesen, die im November 2012 aus dem DWH-betroffenen Gebiet entnommen wurden, darunter eine direkt entnommene Probe über dem Bohrlochkopf (20-POST-MC253 und 19-POST-MC252). Methylophaga sind bekannte Methylotrophe – potenziell abbauende Nebenprodukte des komplexen biologischen Ölabbaus –, können aber auch Hexadecan oxidieren, was diesen Mikroorganismen eine potenziell wichtige Rolle im Kohlenwasserstoffkreislauf an natürlichen Sickerstellen verleiht. Darüber hinaus waren Bacteroidetes in Proben nach der Entlassung (23 % aller Sequenzen, 14-POST-MC422; Abbildung 2, Ergänzungstabelle S3) im Vergleich zu Proben vor der Entlassung und Entlassung (4 % und 14 % aller Sequenzen, jeweils). Wie Methylophaga können die Bacteroidetes möglicherweise sekundäre Metaboliten des biologischen Abbaus von Methan oder aus Öl gewonnenen Verbindungen verbrauchen.

Mitglieder der Gattung Alteromonas blühten in der Umgebung nach der Entlassung (29 % aller Sequenzen, 14-POST-MC422; Abbildung 2). Diese Taxa, die auch in natürlichen Sickerproben vorkommen, wenn auch mit geringerer Häufigkeit (1-PRE-MC118; 2 %, 17-POST-GC600; 9 % und 18-POST-GC600; 11 %), könnten als einheimische PAK-Abbauer fungieren ( Jin et al., 2012; Math et al., 2012). Die Probe aus GC600, einem produktiven natürlichen Kohlenwasserstoffsicker, beherbergte ebenfalls reichlich Pseudoalteromonas-Populationen (40 % aller Sequenzen, 18-POST-GC600); Diese Mikroben können auch PAK abbauen (Hedlund und Staley, 2006). Wir haben Pseudoalteromonas nur in natürlichen Sicker- und Nachentladungsproben (2–7 % aller Sequenzen) nachgewiesen, nicht jedoch in Proben, die während der Entladung gesammelt wurden. Es ist möglich, dass diese Mikrobengruppe den Umweltbedingungen während der Einleitung nicht gewachsen war; Alternativ könnten diese Organismen so schnell reagiert haben, dass sie zwischen unseren Probenahmebemühungen blühten und abstürzten, und so möglicherweise übersehen worden sein.

Die Oligotypisierung treibt das Gebiet der mikrobiellen Ökologie erheblich voran (Eren et al., 2013), indem sie Einblicke in die subtilen Sequenzvariationen zwischen virulenten und nicht pathogenen Mikroorganismen (Eren et al., 2011), wirtsspezifischen Fäkalien-Indikatorbakterien (McLellan et al ., 2013), marine SAR11-Oligotypen (Eren et al., 2013) und Wirtsspezifität in in Schwämmen gehaltenen mikrobiellen Gemeinschaften (Reveillaud et al., 2014). Wichtig ist, dass die Methode immun gegen Komplikationen ist, die durch das Auftreten mehrerer Kopien des 16S-rRNA-Gens entstehen. Wenn beispielsweise zwei verschiedene Oligotypen aus demselben Genom stammen, sollten sie in Datensätzen, die dieses Genom enthalten, immer gleichzeitig vorkommen. Dies wurde im vorliegenden Datensatz nie festgestellt. Stattdessen wiesen Oligotypen unterschiedliche Erscheinungsmuster auf, die nicht durch das Vorhandensein mehrerer Genkopien erklärt werden können. Somit verbessert die Oligotypisierung die Interpretation der 16S-rRNA-Gensequenzvielfalt und ermöglicht die Quantifizierung ökologisch relevanter Veränderungen in mikrobiellen Populationen auf der Ebene spezifischer Ökotypen (Ward, 1998; Eren et al., 2013). Wir haben 21 Oligotypen von Oceaniserpentilla (das entspricht 97,4 % aller Lesevorgänge in dieser Gattung), 31 Oligotypen von Cycloclasticus (92,4 %) und 26 Oligotypen von Colwellia (94 %) aufgelöst. Jeder Oligotyp hatte eine Ähnlichkeit von mindestens 96 % mit Sequenzen in der NCBI-Nr.-Datenbank. Die Oligotypen von Oceaniserpentilla waren zwischen 97 und 99 % den sequenzierten Vertretern von Oceaniserpentilla haliotis (NR_042641.1) ähnlich; Die Oligotypen von Cycloclasticus stimmten zu 96–100 % mit Cycloclasticus zancles (NC_021917.1) und Cycloclasticus sp. überein. P1 (NC_018697.1); und die Oligotypen von Colwellia waren zu 96–100 % denen von Colwellia psychrerythraea (NC_003910.7) ähnlich.

Wir haben auch eine Oligotypisierung an 64.701 SAR11-klassifizierten Sequenzen durchgeführt, um zu beurteilen, ob das Verfahren bei einem anderen allgegenwärtigen Mitglied der mikrobiellen Gemeinschaft zu Verteilungsmustern führen würde, denen ein klares, aussagekräftiges ökologisches Signal fehlt. Auf ähnliche Weise wählten wir 14 Nukleotidpositionen mit hoher Entropie aus, die 98 Oligotypen erzeugten. Alle generierten SAR11-Oligotypen waren den Vertretern in der NCBI-Nr.-Datenbank zu mindestens 98 % ähnlich. Im Gegensatz zum Verfahren mit den anderen oligotypisierten Taxa führte die Erhöhung der Anzahl der Nukleotidpositionen pro Iteration der Oligotypisierung nicht dazu, unterschiedliche Häufigkeitsmuster von SAR11-Oligotypen innerhalb der Proben zu unterscheiden.

Bei der Untersuchung dieses umfassenden räumlich und zeitlich unterschiedlichen Datensatzes mittels Oligotypisierung zeigten die Morisita-Horn-Indizes im Vergleich zu den Ergebnissen, die wir für alle OTUs erhalten haben (Abbildungen 1a und b), sehr ähnliche Muster, was darauf hindeutet, dass die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft hauptsächlich durch Variationen erklärt wird in den Oligotypen Oceaniserpentilla, Cycloclasticus und Colwellia. Die Oligotyp-Zusammensetzungen in Entladungsproben unterschieden sich von denen vor und nach der Entladung (Morisita-Horn-Indizes 0,5–1; Abbildung 1b), was zeigt, dass einzigartige Ökotypen zu bestimmten Zeiten vor, während und nach der Entladung auftraten.

Die Untersuchung der relativen Häufigkeiten auf der Sub-OTU-Ebene ergab zuvor nicht erkannte unterschiedliche Taxa innerhalb von Oceaniserpentilla, Cycloclasticus und Colwellia, die bedeutende ökologische Variationen widerspiegelten. Oligotypen, die in Proben angereichert wurden, die während der Entladung gesammelt wurden, als die Kohlenwasserstoffverfügbarkeit in der Tiefseefahne sehr groß war, stellten einzigartige Populationen dar, verglichen mit denen, die natürliche Sickerstellen oder Proben aus Plume-Proben dominieren, wo die Kohlenwasserstoffverfügbarkeit viel geringer war. In der Ökologie bezieht sich das Konzept der R- und K-Strategen auf die Wachstumsrate einer Bevölkerung und die Tragfähigkeit einer bestimmten Umgebung (Andrews und Harris, 1986). Wir gehen davon aus, dass die während der Ölkatastrophe in der mit Kohlenwasserstoffen angereicherten Tiefwasserfahne angereicherten Taxa schnell wachsende R-Strategen waren, die schnell auf sich ändernde Bedingungen reagieren konnten, im Vergleich zu langsam wachsenden K-Strategen, die in Umgebungen mit stabileren Bedingungen leben. Obwohl natürliche Sickerstellen entweder durch langsame diffuse oder gepulste schnelle Kohlenwasserstoffversickerung gekennzeichnet sein können (K- vs. R-Strategen), bot die DWH-Entladung offenbar eine vorteilhafte Umweltnische für R-Strategen.

Als Reaktion auf die DWH-Ölableitung wurden im Vergleich zu den Bedingungen vor der Ableitung tiefgreifende Veränderungen in der Verteilung von Oceaniserpentilla, potenziellen Cycloalkan-Oxidatoren (Mason et al., 2012), festgestellt. Bei der Untersuchung der Oligotypverteilung von Oceaniserpentilla unterschieden sich die Proben vor der Entladung (1-PRE-MC118 und 2-PRE-MC118; Morisita-Horn-Index 1,0; ergänzende Abbildung S2a) von allen anderen Proben. Vor der Entladung reichlich vorhandene Oligotypen (Typ_18, Typ_19; Abbildung 3) wurden während oder nach der DWH-Entladung nicht nachgewiesen. Basierend auf der phylogenetischen Analyse von 16S-rRNA-Gensequenzen nahezu voller Länge zusammen mit Oligotypsequenzen sind Oligotypen vor der Entladung (Typ_18, Typ_19) eng mit Taxa verbunden, die nicht mit der DWH-Ölentladung in Verbindung stehen, was wahrscheinlich die natürliche Hintergrundgemeinschaft widerspiegelt. Im Gegensatz dazu wurden während der Entladung verschiedene Oceaniserpentilla-Oligotypen (Typ_01, Typ_02, Typ_10; Abbildung 3) beobachtet, die mit spp. verwandt sind. in DWH-Ölfahnenproben in früheren Studien nachgewiesen (z. B. Zugriffsnummern JN015209, HM587888-90; ergänzende Abbildung S3; Hazen et al., 2010). Nach der Entladung waren zahlreiche Oceaniserpentilla-Oligotypen (Typ_10, ~6 %, Typ_16, ~5 %, Typ_21, ~92 % aller Oligotypen; Abbildung 3) eng mit spp. verwandt. während der DWH-Ölableitung nachgewiesen (z. B. Zugriffsnummern HM587889, JN015210; ergänzende Abbildung S3; Hazen et al., 2010) sowie auf spp. identifiziert während 13C-Ethan- und 13C-Propan-Stabilisotopensondierungsexperimenten mit Meerwasser aus dem Golf (z. B. gemäß den Nummern JN018486, JN018459; Redmond und Valentine, 2012) und zu spp. nicht mit der DWH-Ableitung verbunden. Es bleibt unklar, ob Veränderungen in den Oceaniserpentilla-Oligotypen, die während und nach der Ölkatastrophe reichlich vorhanden waren (Typ_10, Typ_21), sowie ein Oligotyp, der sich nach der DWH-Öleinleitung anreicherte (Typ_16, 25 % aller Oligotypen, 18-POST-GC600), eine lange Zeit widerspiegeln -langfristige Auswirkungen der Verschüttung.

Relative Häufigkeit der Oligotypen Oceaniserpentilla (a), Oligotypen Cycloclasticus (b) und Oligotypen Colwellia (c), die während der DWH-Ölkatastrophe eine Schlüsselrolle spielten. Die Oligotypisierung ermöglichte die Interpretation der Diversität der 16S-rRNA-Gensequenzen auf der Ebene spezifischer Ökotypen. Die Dynamik der Oligotypen wurde in Proben vor, bei der Entladung und nach der Entladung überwacht.

Für die potenziellen PAK-Abbauer, die mit Cycloclasticus assoziiert sind (Dyksterhouse et al., 1995), war die Ökotypverteilung vor und während der Einleitung ähnlich (Morisita-Horn-Index <0,1–0,5; ergänzende Abbildung S2b). Nach der Entlassung zeigten drei Proben ähnliche Cycloclasticus-Ökotypen (14-POST-MC422, 15-POST-MC298 und 16-POST-MC297; Morisita-Horn-Index <0,1–0,3), während weitere drei Proben einzigartig waren (18-POST). -GC600, 19-POST-MC252 und 20-POST-MC253; Morisita-Horn-Index 0,9–1). Der dominante Oligotyp, der vor dem DWH-Vorfall entdeckt wurde (Typ_01, 74–94 % aller Oligotypen, 1-PRE-MC118 und 2-PRE-MC118; Abbildung 3), war während (29–81 % aller Oligotypen) und in großer Häufigkeit vorhanden nach der Entlassung (bis zu 34 % aller Oligotypen, 19-POST-MC252). Dieser Oligotyp_01 ist phylogentisch mit spp. verbunden. in den Tiefseefahnenproben in früheren Studien nachgewiesen (Zugriffsnummern JN018748, JN018827, JN018869, JN018988 und HQ222992; ergänzende Abbildung S4; Redmond und Valentine, 2012; Valentine et al., 2012). Darüber hinaus sind Cycloclasticus-Oligotypen (Typ_02, Typ_07) in Proben nach der Entlassung reichlich vorhanden (bis zu 100 % und 44 %, 15-POST-MC298 und 16-POST-MC297; Abbildung 3), geclustert mit spp. nachgewiesen in Proben aus früheren DWH-Studien (HQ433397, JN019017, HQ222993; Valentine et al., 2010; Kessler et al., 2011b; Redmond und Valentine, 2012). Die Verteilungen dieser Oligotypen zeigen, dass die Cycloclasticus, die in natürlichen Kohlenwasserstoffsickern im Golf leben, offenbar in der Lage waren, den Umweltstörungen infolge der DWH-Einleitung zu widerstehen, und wahrscheinlich während des Vorfalls am biologischen Ölabbau beteiligt waren.

Für die Colwellia, die mutmaßliche kurzkettige Alkanabbauer enthalten (Redmond und Valentine, 2012), zeigte die Oligotypverteilung ähnliche Muster vor der Entladung (Morisita-Horn-Index <0,1; ergänzende Abbildung S2c) und während der Entladung (Morisita-Horn-Index 0,1). –0,8). Wir haben in der gesamten Zeitreihe einen Oligotyp (Typ_04) entdeckt. Die phylogenetische Analyse zeigte, dass dieser Oligotyp eng mit Organismen verwandt ist, die sowohl in natürlichen Sickerproben als auch in DWH-beeinflussten Proben nachgewiesen wurden (Abbildung 4; Acc.-Nr. JN018846; Redmond und Valentine, 2012), was zeigt, dass einige Colwellia spp. Die an natürlichen Kohlenwasserstoffsickern vorhandenen Substanzen waren in der Lage, die hohen Gas-, Öl- und Dispersionsmittelkonzentrationen im Tiefwasser während der DWH-Entladung zu bewältigen. Allerdings nahm die relative Häufigkeit dieses Oligotyps während der Entladung im Vergleich zu den Proben vor der Entladung erheblich ab (von 72–86 % auf 0–13 % aller Oligotypen; Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass die Colwellia-Population während der Entladung von nicht sickernden einheimischen Mikroorganismen dominiert wurde die Verschüttung. Dementsprechend sind die häufigsten Colwellia-Oligotypen während der DWH-Entladung (Typ_01, ⩽43 %, Typ_02, ⩽56 %, Typ_03, ⩽25 %, Typ_05, ⩽22 %, Typ_06, ⩽24 %, Typ_07, ⩽13 %). und Typ_08, jeweils ⩽8 % aller Oligotypen; Abbildung 3) waren eng mit Mikroben verwandt, die in früheren Studien in Tiefwasserfahnenproben nachgewiesen wurden (z. B. gemäß den Nummern JN018749, JN018846 und JN019018; Redmond und Valentine, 2012) oder zu Organismen, die in Experimenten zur Untersuchung stabiler Isotope mit 13C-Methan, 13C-Ethan und 13C-Propan identifiziert wurden (Bezugsnummern JN018467, JN018427, JN018472 und JN019018; Redmond und Valentine, 2012; Abbildung 4). Colwellia-Oligotypen, die die Proben während der Entladung dominierten (> 5 % relative Häufigkeit während der DWH-Ölpest; Abbildung 4), schienen im 16S-rRNA-Genbaum und in den über die Colwelliaceae verstreuten Sequenzen auffallend vielfältig, was der Bildung phylogenetisch unterschiedlicher Cluster entgegenstand. Die während der DWH-Ölkatastrophe festgestellte phylogenetische Vielfalt von Colwellia spiegelt wahrscheinlich die physiologische Vielfalt dieser Gruppe und ihre Fähigkeit wider, auf eine Reihe von Umweltbedingungen zu reagieren. Interessanterweise ist Colwellia sp. RC25, isoliert mit MC252-Öl aus DWH-kontaminiertem Wasser (Bælum et al., 2012), ist nicht eng mit den Taxa verwandt, die während der DWH-Öleinleitung in früheren Berichten entdeckt wurden, oder mit einem der hier berichteten Colwellia-Oligotypen (Abbildung 4). Obwohl die Sorte Colwellia sp. RC25 (Bælum et al., 2012) dient als wertvoller Modellorganismus, dessen Physiologie (z. B. Substratpräferenzen, optimale Wachstumsbedingungen und Aktivität) möglicherweise nicht die der Colwellia-Ökotypen widerspiegelt, die während der DWH-Entladung dominierten.

Phylogenetische Beziehungen von Colwellia-Oligotypen (fett) mit eng verwandten Arten. einschließlich kultivierter Vertreter. Der Baum wurde durch Maximum-Likelihood-Analyse berechnet. Oligotypen, die während der DWH-Ölabgabe potenziell aktiver waren, werden in roter Schrift angezeigt. Die Farbkodierung der Kugeln entspricht der Oligotyp-Kennzeichnung in Abbildung 3. Darüber hinaus sind Oligotypen, die signifikant mit Methan und/oder Methanoxidation korrelieren, mit [CH4] und/oder [MOx] gekennzeichnet. Die Anzahl der Lesevorgänge, die im selben Oligotyp geclustert wurden, ist im vollständigen Namen angegeben. Der Balken stellt eine geschätzte Sequenzdivergenz von 10 % dar.

Wir haben außerdem die Beziehungen zwischen Umweltparametern und der Verteilung der Oligotypen Colwellia, Cycloclasticus und Oceaniserpentilla in den Proben mithilfe von R (R-Core-Team, 2012), veganen Paketen (Oksanen et al., 2013) und qvalue (Klaus und Strimmer, 2012) untersucht. . Spearmans Rangkorrelationskoeffizient ρ für jede Oligotypverteilung und jeden Umgebungsparameter sowie Storeys Korrektur der Falscherkennungsrate für mehrere Tests bei q<0,05 zeigten signifikante (P<0,05) Korrelationen. Da die Oligotypisierung subtile Variationen von 16S-rRNA-Genen auflöst, die unterschiedliche Ökotypen darstellen (Ward, 1998; Eren et al., 2013), argumentieren wir, dass Oligotypen, die signifikant mit Umweltparametern korrelieren, wahrscheinlich unterschiedliche Ökotypen darstellen. Die relative Häufigkeit von sechs Colwellia-Oligotypen (Typen_01, 02, 03, 04, 06, 09), drei Cycloclasticus-Oligotypen (Typen_04, 06, 30) und einem Oceaniserpentilla-Oligotyp (Typ_17) spiegelte stark die erhöhten Methankonzentrationen in der Kohlenwasserstofffahne der Tiefsee wider; Dieselben Proben wiesen auch hohe Konzentrationen an farbigem gelöstem organischem Material auf, ein guter Indikator für gelöstes Öl (Wade et al., 2013; Ergänzungstabelle S5). Die aufeinanderfolgenden Blüten verschiedener Colwellia-Oligotypen spiegeln wahrscheinlich Übergänge zwischen verschiedenen ökologischen Nischen wider, beispielsweise unterschiedliche Substratpräferenzen bestimmter kurzkettiger Alkane, Dispergiermittel oder anderer organischer Verbindungen. Darüber hinaus korrelierten höhere Messungen der Methanoxidationsrate mit höheren Häufigkeiten von drei Colwellia-Oligotypen (Typen_01, 04 und 06) und drei Cycloclasticus-Oligotypen (Typen_01, 06 und 30). Bisher ist weder von Colwellia noch von Cycloclasticus bekannt, dass sie Methan oxidieren, das heißt, ihre Genome weisen keine metabolische Fähigkeit auf, Methan zu oxidieren (Lai et al., 2012; Mason et al., 2014). Die positive Korrelation dieser Oligotypen mit den Methanoxidationsraten impliziert jedoch entweder ihre indirekte Beteiligung an diesem Prozess (z. B. durch Oxidation von Co-Metaboliten oder Reaktionsnebenprodukten) oder ihre Koexistenz mit Methanoxidationsmitteln (z. B. in Fahnenproben, wo Methan, Alkane und PAK nebeneinander existierten) oder möglicherweise ein unerkanntes Potenzial zur Oxidation von Methan.

Um die beobachteten Muster in der Gemeinschaftsfolge mutmaßlicher öloxidierender Bakterien zu begründen, haben wir ein allgegenwärtiges Gemeinschaftsmitglied, SAR11, oligotypisiert, um zu bestätigen, dass das Verfahren keine Muster erzeugte, denen eine klare ökologische Bedeutung fehlte (Ergänzungsabbildungen S2d und S5, Ergänzungstabelle S3). Wir haben auch die Beziehungen der SAR11-Population zu Umweltparametern bewertet. Die relative Häufigkeit von 27 SAR11-Oligotypen korrelierte negativ mit der Zellzahl, den Methankonzentrationen (Typen_42, 66 und 90) und den Methanoxidationsraten (Typen_37, 42, 43, 66 und 90; Ergänzungstabelle S5). Daher deutete die Oligotypisierung nicht darauf hin, dass SAR11 eine Rolle in der Kohlenwasserstoffdynamik spielt, wie dies aufgrund der bekannten ökologischen und metabolischen Strategien von SAR11 zu erwarten war. Die Genome von Pelagibacter spp. sind für einen geringeren Energiebedarf und Kohlenstoffmangel unter oligotrophen Bedingungen im offenen Ozean optimiert (Steindler et al., 2011). In der Tiefe des nördlichen Golfs von Mexiko nimmt die SAR11-Repräsentation ab, wohingegen Kohlenwasserstoff-assoziierte Gammaproteobakterien wie Colwellia, Cycloclasticus und Oceaniserpentilla überwiegen (Giovannoni et al., 2005). Interessanterweise zeigten zwei SAR11-Oligotypen (Typen_68 und 73) starke positive Korrelationen mit den NOx-Konzentrationen (Nitrit plus Nitrat). Obwohl SAR11 in marinen Meerwasserumgebungen weltweit häufig vorkommt (Morris et al., 2002), wurden sowohl negative (Eiler et al., 2009) als auch positive (Teira et al., 2009) Korrelationen von marinem SAR11 mit der Ammonium- und Nitratkonzentration berichtet . Daher können SAR11-Mitglieder auf ökologische Nischen spezialisiert sein, die durch die Verfügbarkeit von Nährstoffen definiert sind.

Die Bewertung der relativen Häufigkeit der Oligotypen Oceaniserpentilla, Cycloclasticus und Colwellia auf der Sub-OTU-Ebene in einem räumlich und zeitlich vielfältigen Datensatz aus natürlichen Sickerstellen und Gebieten, die von der DWH-Ölkatastrophe im Golf betroffen waren, ergab ein bisher unerkanntes Maß an Diversität dieser Kohlenwasserstoffe Degradatoren und eine klare Entwicklung der Taxaverteilung im Laufe der Zeit während des DWH-Vorfalls. Bestimmte Ökotypen, die natürliche Sickerstellen bewohnen, waren potenziell in der Lage, mit den Bedingungen der Tiefwasserwolken zurechtzukommen. Das Einwachsen von Oceaniserpentilla, Cycloclasticus und Colwellia wurde jedoch von Taxa dominiert, die normalerweise nicht an natürlichen Kohlenwasserstoffsickern beobachtet werden. Zukünftige Charakterisierungen dieser potenziell spezialisierten Ökotypen durch Kultivierung und physiologische Experimente sowie zusätzliche Analysen sowohl von Funktions- als auch Markergenen werden das Wissen über ihre ökologische Relevanz in der Meeresumwelt erweitern. Darüber hinaus werden solche Analysen mehr Einblicke in die Umweltfaktoren liefern, die zu ihrer zunehmenden Dominanz während der Ölkatastrophe geführt haben.

Die Oligotypisierung bot eine Möglichkeit, die Reaktion mikrobieller Taxa, die während dieser akuten Umweltstörung wahrscheinlich unterschiedliche Ökotypen repräsentieren, mit großer Präzision zu quantifizieren. Ebenso eignet sich dieser Ansatz zur Beurteilung der Taxa-Entwicklung als Reaktion auf andere akute und chronische Umweltstörungen wie Eutrophierung, Hurrikane, Tsunamis oder Klimawandel. Verschiedene, wahrscheinlich spezialisierte Taxa mit geringer Häufigkeit reagierten innerhalb weniger Wochen auf die DWH-Kohlenwasserstoffinfusion. Die Fähigkeit dieser Mitglieder der seltenen Biosphäre, nach einer massiven Störung Aktivität und Häufigkeit zu steigern, verdeutlicht das vielfältige und große Stoffwechselpotenzial der natürlichen Mikrobenpopulation des Golfs.

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Diese Forschung wurde von den Biological and Chemical Oceanography Programs der US National Science Foundation (OCE-1043225 an SBJ), dem NOAA National Institute for Undersea Science and Technology (Preisnummern 0710028 und 0810031 an SBJ) und einem Zuschuss von BP/The Gulf of unterstützt Mexiko-Forschungsinitiative zur Unterstützung des Konsortiums „Ecosystem Impacts of Oil and Gas Inputs to the Gulf (ECOGIG)“ und des Deep Carbon Observatory and Census of Marine Life Programs der Sloan Foundation (an MS). Dies ist der ECOGIG-Beitrag 203 und die Daten sind unter der GRIIDC-Erfassungsnummer (UDI: R1.x132.134:0079) hinterlegt.

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Sharon Grim & Mitchell Sogin

School of Earth and Atmospheric Sciences, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

Annalisa Bracco

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Korrespondenz mit Samantha B. Joye.

Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 31. Oktober 2014

Überarbeitet: 21. Mai 2015

Angenommen: 3. Juni 2015

Veröffentlicht: 31. Juli 2015

Ausgabedatum: Februar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/ismej.2015.121

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