Funktionen des menschlichen Riechschleims und Alter

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 971 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Gerüche werden von olfaktorischen sensorischen Neuronen wahrgenommen, die von olfaktorischem Schleim bedeckt sind. Trotz der Existenz von Studien zum Geruchsschleim sind seine Bestandteile, Funktionen und interindividuellen Variabilität noch immer kaum verstanden. Hier beschreiben wir eine Humanstudie, die die Sammlung von Geruchsschleim und olfaktorische psychophysische Tests kombinierte. Unsere Analysen ergaben, dass Riechschleim hohe Konzentrationen an gelösten Stoffen enthält, wie z. B. Gesamtproteine, anorganische Elemente und Moleküle für den xenobiotischen Stoffwechsel. Die hohen Konzentrationen führen zu der Fähigkeit, ein spezifisches Repertoire an Geruchsstoffen einzufangen oder zu verstoffwechseln. Wir liefern Beweise dafür, dass der Geruchsstoffstoffwechsel unseren Geruchssinn verändert. Schließlich nimmt die Menge des Riechschleims altersabhängig ab. Ein Folgeexperiment verdeutlichte erneut die Bedeutung der Schleimmenge für die empfindliche Erkennung von Geruchsstoffen durch ihre Rezeptoren. Diese Ergebnisse liefern ein umfassendes Bild der molekularen Prozesse im Riechschleim und legen eine mögliche Ursache für den Geruchsrückgang nahe.

Informationen über Geruchsstoffe werden genutzt, um Gefahren zu erkennen, Lebensmittel auszuwählen und zu schmecken sowie andere Personen zu erkennen und mit ihnen zu kommunizieren. Eine verminderte Geruchsfähigkeit erhöht das Risiko einer persönlichen Gefahr und ist mit vermindertem Appetit, körperlichen und geistigen Problemen und letztendlich einer geringeren Lebensqualität (QOL) verbunden1,2. Die Bedeutung des Geruchssinns wurde durch die Coronavirus-Pandemie 2019 noch deutlicher, da die Erkrankung häufig zu Geruchsstörungen führt3. Mit zunehmendem Alter und der Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit lässt die Geruchsfunktion häufig nach4. In unserer immer älter werdenden Gesellschaft kommt es auch vermehrt zu altersbedingtem Rückgang des Geruchsvermögens. Um eine wirksame Behandlungsstrategie zu entwickeln, ist es erforderlich, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Geruchsstörung zugrunde liegen.

Inhalierte Geruchsstoffe erreichen den Riechspalt (OC) oben in der Nasenhöhle. Im OC verstreute olfaktorische sensorische Neuronen (OSNs) erkennen Gerüche mithilfe von etwa 400 Geruchsrezeptoren (ORs) und übermitteln Geruchsinformationen über den Riechkolben an höhere Gehirnbereiche5. Darüber hinaus deuten neue Erkenntnisse darauf hin, dass wahrscheinlich ein wichtiger Prozess abläuft, bevor Geruchsstoffe von den OPs erkannt werden. Das OC von Säugetieren ist von einer dünnen Schicht Riechschleim bedeckt, der von Bowman-Drüsen und Sustentakularzellen abgesondert wird6. Riechschleim enthält verschiedene Komponenten, darunter geruchsbindende Proteine ​​(OBPs), Stoffwechselenzyme und bioanorganische Elemente7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Aufgrund der Fähigkeit dieser Komponenten, mit Geruchsstoffen zu interagieren, spielen sie eine wichtige Rolle bei der effizienten Geruchsbildung beim Menschen, indem sie flüchtige Stoffe zu den Geruchsstoff-Bindungsstellen von ORs transportieren oder durch den enzymatischen Metabolismus von Geruchsstoffen in ungiftige Strukturen und/oder Strukturen mit höherer Affinität für OPs. Ein kontinuierlicher Schleimfluss kann ein effizientes Waschen der Schleimhaut und die stetige Beseitigung von Geruchsstoffen gewährleisten, was einen entscheidenden Schritt bei der Wiederherstellung der Empfindlichkeit nach der Exposition gegenüber Geruchsstoffen darstellt22. Direkte Beweise für die Funktionen des Riechschleims und ihre Bedeutung für die Wahrnehmung sind selten, da es schwierig ist, ausreichend reinen Riechschleim für Analysen zu entnehmen. In einigen Studien wurde Geruchsschleim als Kochsalzlösung aus einer gespülten Nasenhöhle gewonnen, was zu einer Verdünnung führte und Verunreinigungen aus den umliegenden Regionen einschloss7,8. Obwohl andere direkt reine Geruchsschleimproben von menschlichen Teilnehmern gesammelt haben, haben sie nur begrenzte Einblicke in seine Funktionen berichtet9,10,11,13,14.

Der altersbedingte Rückgang des Geruchssinns ist in der Bevölkerung im Alter von ≥ 65 Jahren weit verbreitet und es gibt keine etablierte Behandlung. Dieser Rückgang wurde in mehreren Aspekten der olfaktorischen Fähigkeiten berichtet, darunter Sensibilität, Unterscheidungsvermögen, Identifikation und Erholung von der Anpassung23,24,25,26. Es wurden einige mögliche Ursachen für den Geruchssinn im Alter vorgeschlagen27. Eine altersabhängige Degeneration des Neuroepithels, einschließlich Basalzellanomalien, wurde sowohl in Tiermodellen als auch beim Menschen regelmäßig beobachtet28,29,30,31,32. Diese Degeneration führt zu einer verringerten Anzahl von OSNs und verursacht atrophische Veränderungen im Riechkolben33,34. Eine frühere Studie deutete auf altersbedingte Veränderungen im Expressionsniveau von ORs35 hin, obwohl eine andere Studie darauf hinwies, dass sie während des Alterns ein stabiles Expressionsmuster aufwiesen36. Veränderungen in höheren Hirnregionen sind an altersbedingten Funktionsdefiziten beteiligt37. Der Beitrag dieser Veränderungen zum olfaktorischen Rückgang bleibt jedoch unklar. Wir führten eine Zusammenhangsstudie zwischen dem altersbedingten Rückgang der Geruchsempfindlichkeit und dem Geruchsschleim-Proteom durch10. Obwohl festgestellt wurde, dass mehrere Proteine ​​mit der Geruchsempfindlichkeit assoziiert sind, schien keines direkt an der Erkennung von Geruchsstoffen beteiligt zu sein, gegenüber denen ältere Menschen eine verminderte Empfindlichkeit haben. Daher bleibt die Hauptursache für altersbedingte Defizite im Geruchssinn ungeklärt.

Diese Studie klärte die Funktionen des menschlichen Riechschleims und seine altersabhängigen Veränderungen auf. Wir haben eine Studie durchgeführt, die die Sammlung von reinem Geruchsschleim mit Geruchstests kombinierte. Wir führten auch Folgeexperimente in vitro und in vivo durch, um die beobachteten funktionellen Zusammenhänge zu erklären.

Eine Beschreibung der grundlegenden Eigenschaften und Funktionen des reinen Riechschleims beim Menschen fehlt. Wir haben Geruchsschleim direkt von 30 gesunden Teilnehmern ohne sensorische Beschwerden im Alter von 20–67 Jahren gesammelt. Nach der Instillation von topischem Lidocain wurde unter direkter Visualisierung mit einem Endoskop ein neurochirurgisches Pad in der Riechfurche zwischen der mittleren Nasenmuschel und dem oberen Nasenseptum (OC, Abb. 1a) sowie zwischen der unteren Nasenmuschel und dem unteren Nasenseptum (INM) platziert. Nach 5 Minuten wurde der von den Pads absorbierte Geruchsschleim gesammelt und anschließenden Analysen unterzogen.

Grundlegende Eigenschaften und individuelle Variabilität des Riechschleims. (a) Schematische Zeichnung der menschlichen Nasenhöhle, die den Ort der in dieser Studie entnommenen Schleimproben zeigt. Schleimproben wurden aus der Riechspalte (OC) und dem unteren Nasengang (INM) entnommen. (b) Verteilung und Mittelwert (rote horizontale Linie) der von 30 Teilnehmern gesammelten Nasenschleimmenge. Jeder Punkt stellt die durchschnittliche Schleimmenge aus dem linken und rechten Nasenloch einer Person dar. (c) Wetterabhängigkeit der Menge des gesammelten INM-Schleims. Die Menge an INM-Schleim wurde auf die Menge an OC-Schleim normalisiert. Die Whisker-Diagramme zeigen den Median, das erste und dritte Quartil sowie die oberen und unteren Grenzen in den Gruppen „Regenwetter“ (n = 6) und „Sonnenwetter“ (n = 24). (d) Verteilung der Gesamtproteinkonzentration im OC-Schleim (n = 30), INM-Schleim (n = 29) und im Speichel (n = 30). (e) Korrelation zwischen der Menge und der Proteinkonzentration im OC-Schleim (n = 30). (f–i) Verteilung der Mg-, Fe-, Cu- und Zn-Konzentrationen im OC-Schleim (n = 29), INM-Schleim (n = 29) und Speichel (n = 30). Im Speichel wurden keine Cu-Ionen nachgewiesen. (j) Frauenspezifische Anreicherung von Zn im OC-Schleim. Es wird die Zn-Konzentration im Schleim von 14 weiblichen und 15 männlichen Teilnehmern aufgezeichnet. (k) Konzentration von Gesamtglutathion (tGSH), oxidiertem Glutathion (GSSG) und reduziertem Glutathion (rGSH) im OC-Schleim (n = 30). (l) Dosis-Wirkungs-Analyse der Aktivierung von OR2T11-exprimierenden HEK293T-Zellen gegen 0,1 mM oder 1 mM tert-Butylmercaptan (tBM) mit steigenden Konzentrationen von CuCl2, ergänzt im Zellkulturmedium. Die Daten werden als Mittelwert ± SE aus drei unabhängigen Experimenten angezeigt. Ohne OR2T11 transfizierte Zellen wurden ebenfalls getestet (Schein). (m) Es wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Cu-Konzentration im OC-Schleim und dem Riechschwellenwert festgestellt (n = 28 Teilnehmer). Auch die Korrelation nach Spearman war statistisch nicht signifikant (P > 0,05). Die Signifikanz wurde mit einem Mann-Whitney-U-Test bewertet. *, P = 0,0255; **, P = 0,0043.

Die Menge der gesammelten Schleimproben unterschied sich erheblich zwischen den Teilnehmern und folgte keiner Normalverteilung (P <0, 01, Shapiro-Wilk-Normalitätstest, Abb. 1b, Ergänzungstabelle 1). Das Gewicht der OC-Schleimproben lag zwischen 7 und 144 mg (Median: 36,9 mg) pro Nasenhöhle bei 30 Teilnehmern, während das des INM-Schleims zwischen 0 und 135 mg (Median: 45,2 mg) lag. Diese Abweichungen wurden nicht durch technische Probleme verursacht, da die Mengen an OC-Schleim, die von jeder Seite des Nasenlochs durch unabhängige Verfahren gesammelt wurden, korrelierten (Spearman-Rho = 0,50, P < 0,01); Diese Schlussfolgerung wurde auch durch den signifikanten Zusammenhang zwischen der Menge des von jedem Probanden erhaltenen OC- und INM-Schleims gestützt (Spearman-Rho = 0,56, P <0,01, ergänzende Abbildung 1a), was darauf hindeutet, dass die individuelle Variabilität der Menge des gesammelten Schleims verursacht wurde durch einen oder mehrere intrinsische Faktoren.

Die individuelle Variation der INM-Schleimmengen hing mit intrinsischen Faktoren und dem Umgebungsfaktor Luftfeuchtigkeit am Tag der Probenahme zusammen. Die Menge an INM-Schleim schien bei sonnigem Wetter (relative Luftfeuchtigkeit 42 %) geringer zu sein als bei Regenwetter (71–100 %), was auf eine Dehydrierung des INM-Schleims schließen lässt (ergänzende Abbildung 1b). Im Gegensatz dazu unterschied sich die Menge des gesammelten OC-Schleims nicht je nach Wetterlage. Die Wetterabhängigkeit des INM-Schleims war signifikant, wenn er als normalisierte Werte mit individuell unterschiedlichen Mengen an OC-Schleim analysiert wurde (Abb. 1c). Daher ist INM-Schleim wichtig für die Befeuchtung der eingeatmeten, trockeneren Luft, bevor sie den OC-Schleim erreicht und dehydriert; Andernfalls werden die Funktionen des OC-Schleims beeinträchtigt, wie in der Tracheobronchialschleimhaut berichtet38. Unterdessen legt die Wetterunabhängigkeit nahe, dass individuelle Schwankungen in der Menge an OC-Schleim hauptsächlich auf intrinsische Faktoren zurückzuführen sind.

Die grundlegenden Eigenschaften von OC-Schleim, insbesondere die Konzentrationen an Gesamtprotein und anorganischen Elementen, wurden kaum beschrieben. In dieser Studie haben wir zunächst die Gesamtproteinkonzentration der entnommenen Körperflüssigkeiten mithilfe eines PierceTM-Bicinchoninsäure-Assays (BCA) bestimmt (Abb. 1d). Der OC-Schleim enthielt höhere Proteinkonzentrationen als INM-Schleim oder Speichel. Bemerkenswerterweise schwankte auch die Proteinkonzentration des OC-Schleims erheblich zwischen den einzelnen Personen und lag zwischen 6,2 und 20,8 mg/ml. Sie zeigte einen negativen Zusammenhang mit der gesammelten Menge an OC-Schleim (Abb. 1e).

Ein hoher xenobiotischer Stoffwechsel erfordert eine hohe Konzentration an Enzymen und anorganischen Elementen, die ihre aktiven Zentren bilden. Die Konzentrationen von vier bioanorganischen Spurenelementen (Mg, Fe, Zn und Cu) wurden in allen Proben erfolgreich quantifiziert, mit Ausnahme von Cu aus dem Speichel. Die Konzentrationen von fünf weiteren Elementen, Al, Cr, Mn, Ni und Co, lagen unter der unteren Bestimmungsgrenze (100 ppb für den OC- und INM-Schleim und 5 ppb für den Speichel). Insgesamt enthielt der OC-Schleim mit Ausnahme von Zn höhere Konzentrationen an anorganischen Elementen als der INM-Schleim oder der Speichel (Abb. 1f – i). Die Zn-Konzentration unterschied sich nicht zwischen OC- und INM-Schleim und zeigte eine frauenspezifische Anreicherung (Abb. 1j). In Übereinstimmung mit dem Zweck des xenobiotischen Metabolismus und der Entgiftung haben wir individuell unterschiedliche Konzentrationen eines niedermolekularen Antioxidans, Glutathion39, im OC-Schleim nachgewiesen (Abb. 1k). Die Glutathionkonzentration korrelierte mit der Fe-Konzentration (ergänzende Abbildung 1c). Ähnliche Glutathionkonzentrationen wurden in einer Mischung gleicher Mengen des INM-Schleims der Teilnehmer nachgewiesen: 163 μM oxidiertes Glutathion (GSSG) und 23 μM reduziertes Glutathion (rGSH). Im Speichel hingegen waren keine Glutathionwerte nachweisbar.

Die hohe Cu-Konzentration im OC-Schleim war selbst im Vergleich mit der im Serum bemerkenswert (mittlere Konzentration: 4,8 ppm (75 μM) im OC-Schleim vs. 1,1 ppm im Serum), ähnelte jedoch der im OC-Schleim der Maus geschätzten Messung der Nasenspülflüssigkeit (42 μM)15,40. Dieses Ergebnis scheint angesichts der Tatsache, dass OSNs Cu für die empfindliche Erkennung von Schwefelgeruchsstoffen verwenden, vernünftig zu sein15. Die Cu-Konzentration im OC-Schleim lag zwischen 12,6 und 189 μM, ähnlich dem Konzentrationsbereich, der zur Verbesserung der Reaktionsfähigkeit OR-exprimierender Zellen auf eine Schwefelverbindung, tert-Butylmercaptan (tBM; Abb. 1l)41, wirksam ist. Diese Variable erklärte jedoch nicht die individuelle Varianz der olfaktorischen Empfindlichkeit gegenüber tBM (Abb. 1m). Diese Diskrepanz deutet auf Folgendes hin: (1) eine methodische Einschränkung bei der Unterscheidung proteingebundener Cu-Ionen und freier Cu-Ionen; und (2) das Vorhandensein dominanterer Faktoren, wie etwa die genetische Variation von ORs, die Schwefelgeruchstoffe erkennen, wie bereits zuvor vorgeschlagen42.

Basierend auf den Funktionen von OBPs wurde ein wichtiger funktioneller Aspekt des OC-Schleims vorgeschlagen. Es wurde davon ausgegangen, dass der Zweck ihrer Geruchsstoffbindungsfähigkeit darin besteht, hydrophobe Geruchsstoffe effizient zu lösen und an ORs abzugeben9,22,43,44. Dies basiert jedoch nur auf In-vitro-Analysen mit künstlich hergestellten OBPs; Daher bleibt unklar, ob der OC-Schleim selbst diese Fähigkeit besitzt und zur olfaktorischen Wahrnehmung gebundener Geruchsstoffe beiträgt.

Mindestens zwei mutmaßliche OBPs wurden im menschlichen Geruchsschleim exprimiert, ihre Geruchsstoffbindungsaktivität wurde jedoch nicht charakterisiert. In dieser Studie haben wir die geruchsbindende Aktivität von OC-Schleim untersucht. Vor der Untersuchung des OC-Schleims verwendeten wir Sus scrofa odorant-binding protein-1 (pigOBP), ein gut charakterisiertes Säuger-OBP, um das Experiment durchzuführen45,46. Zunächst wurde gereinigtes rekombinantes Schweine-OBP einem etablierten kompetitiven Bindungstest unter Verwendung des Fluoreszenzliganden 1-Aminoanthracen (1-AMA)44,45,46 unterzogen. Das Ergebnis einer früheren Studie, in der die Fluoreszenz von pigOBP und dem 1-AMA-Komplex durch Bindung eines bekannten Liganden, Citronellol, gelöscht wurde, wurde bestätigt (Abb. 2a–c)46. Mithilfe dieses Bindungstests wurden Ambrettolid (Amb) und L-Menthon als neue Liganden mit einer höheren Affinität für pigOBP identifiziert (Abb. 2b, c). Da der kompetitive Bindungstest eine große Menge an OC-Schleim erfordert, um mehrere Geruchsstoffe zu testen, wurde eine andere Art von Experiment eingesetzt. Die pigOBP-Lösung wurde in einem Glasfläschchen zubereitet und mit drei Liganden gemischt (Abb. 2d). Die Menge der aus der pigOBP-Lösung in den Kopfraum freigesetzten Liganden wurde absorbiert und mithilfe der Festphasen-Mikroextraktion (SPME) und anschließender Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC/MS) gemessen. Liganden mit einer höheren Affinität zu pigOBP im kompetitiven Bindungstest zeigten eine langsamere Freisetzung, was zu niedrigeren Konzentrationen im Kopfraum führte (Abb. 2e, f). Die langsamere Freisetzung wurde durch die Geruchsstoff-einfangende Eigenschaft von pigOBP verursacht, da diese durch die Zugabe des Konkurrenzliganden 1-AMA blockiert wurde (Abb. 2g). Diese Daten validierten das Experiment zur Bewertung der Geruchsstoffaufnahmeaktivität von Schleimproben basierend auf der Geruchsstoffmenge im Kopfraum.

Geruchsstoffbindende Eigenschaft des Riechschleims. (a) Kompetitiver Bindungstest für Schweine-OBP an Geruchsstoffe. Die Daten stellen die Fluoreszenz von Vehikel (Tris-HCl), 10 μM pigOBP, 1 μM 1-AMA und ihrer Mischung dar. (b) Änderung der Fluoreszenz, wenn der Schweine-OBP-1-AMA-Komplex steigenden Konzentrationen an Geruchsstoffen ausgesetzt wurde. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung von Werten aus dem Vehikel und der Mischung aus pigOBP und 1-AMA normalisiert. Fehlerbalken, Standardabweichung über drei Replikate. (c) Chemische Strukturen von Geruchsstoffen. (d) Experimentelles Verfahren zur Quantifizierung der Geruchsstoffbindungskapazität basierend auf den Konzentrationen von Geruchsstoffen im Kopfraum. (e, f) Geruchsstoffaufnahmekapazität von pigOBP. Drei aus der Schweine-OBP-Lösung emittierte Geruchsstoffe wurden extrahiert und mit SPME-GC/MS analysiert. (e) pigOBP reduzierte dosis- und affinitätsabhängig die Freisetzung von Geruchsstoffen aus einer Lösung. (f) Geruchsstoff-einfangende Eigenschaften von 30 μM pigOBP in Abhängigkeit von der Geruchsstoffkonzentration. (g) Zugabe von 1-AMA-induzierter Freisetzung von Geruchsstoffen aus der Schweine-OBP-Lösung. Die Daten werden als prozentuale Peakfläche angezeigt, wobei die erfasste Peakfläche aus der Duftstofflösung ohne pigOBP auf 100 % gesetzt wurde. (h) Individuelle Varianz der Geruchsstoffaufnahmekapazität von OC-Schleim. Relative Kopfraumkonzentration von Geruchsstoffen, die aus 10-fach verdünntem OC-Schleim emittiert werden. Geruchsstoffe wurden mit Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 500 µM zugesetzt. Die Peakfläche jedes Geruchsstoffs ohne OC-Schleim wurde nach Normalisierung mit der Peakfläche von Ethanol auf 100 % gesetzt. (i) Geruchsstoffkonzentrationsabhängigkeit der Kapazität des OC-Schleims. Relative Kopfraumkonzentration von Geruchsstoffen, die aus 10-fach verdünntem OC-Schleim emittiert werden (5–500 μM für Endkonzentrationen). (j) Korrelation der Geruchsstoffaufnahmekapazität und der Proteinkonzentration des OC-Schleims (n = 28). (k) Zusammenhang zwischen der Fähigkeit zur Geruchsstoffaufnahme und der Wahrnehmungsempfindlichkeit gegenüber Amb. OBP, geruchsbindendes Protein; PEA, Phenylethylalkohol.

Es wurden die Geruchsstoff-einfangenden Eigenschaften einer Mischung aus gleichen Volumina OC-Schleim untersucht, die von 30 Teilnehmern erhalten wurde. Die folgenden drei Geruchsstoffe wurden getestet: (1) Amb, das die höchste Affinität zu Schweine-OBP aufweist; (2) Muscone, ein wichtiger Duftstoff aufgrund seiner überlegenen Geruchsqualität; und (3) Phenylethylalkohol (PEA), aufgrund seiner geringen trigeminalen Wirkung der am häufigsten in der Geruchsforschung verwendete Duftstoff47. Die Kopfraumkonzentrationen der drei Geruchsstoffe waren beim Mischen mit dem OC-Schleim deutlich niedriger als mit INM-Schleim, Speichel oder Kochsalzlösung, obwohl wir aufgrund der begrenzten Menge gesammelter Proben keine für die statistische Analyse erforderlichen Testreplikate erstellen konnten (ergänzende Abbildung). 2). Die Kapazität war für Amb immer noch klar und zeigte individuelle Variabilität, selbst wenn der OC-Schleim in zehnfacher Verdünnung aufgetragen wurde (Abb. 2h). Diese verlangsamte Freisetzung hing von der Konzentration von Amb gemischt mit OC-Schleim ab, was mit den beobachteten Eigenschaften von pigOBP übereinstimmt (Abb. 2i). Wir können die Möglichkeit ausschließen, dass die geringere Amb-Konzentration im Kopfraum durch Zersetzung im OC-Schleim verursacht wurde. Dies liegt daran, dass im OC-Schleim verbleibendes Amb nachweisbar war, wenn es mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und per GC/MS analysiert wurde (81 % des Amb wurden aus Kochsalzlösung extrahiert). Die Amb-einfangende Eigenschaft korrelierte positiv mit der Proteinkonzentration im OC-Schleim (Abb. 2j).

Anschließend untersuchten wir, ob die Geruchsstoff-einfangende Aktivität von OC-Schleim mit der Wahrnehmung zusammenhängt, und die Ergebnisse zeigten, dass sie für die empfindliche Erkennung von Amb keine entscheidende Rolle spielt, da keine Korrelation zwischen ihnen beobachtet wurde (Abb. 2k). Die beiden Teilnehmer, deren OC-Schleim überhaupt keine Aufnahmeaktivität für Amb hatte, zeigten im Vergleich zu 30 Teilnehmern einen durchschnittlichen Wert für die Wahrnehmungsempfindlichkeit (7,5 und 3, innerhalb von 0–15; durchschnittlicher Wert: 4,9). Zusammenfassend liefert diese Studie Hinweise darauf, dass menschlicher OC-Schleim eine signifikante Geruchsstoffbindungskapazität aufweist, die nicht mit der Geruchsempfindlichkeit verbunden ist.

Als nächstes beschreiben wir die Stoffwechselkapazität des menschlichen OC-Schleims und seine individuellen Variationen. Zunächst wurden sechs Geruchsstoffe für unsere Experimente ausgewählt, da berichtet wurde, dass sie in OC-Schleimproben metabolisiert werden (Ester: p-Kresylacetat [pCA] 1 und trans-2-Hexenylacetat 15; Aldehyde: Benzaldehyd 23 und Octanal 25; Ketone: 2′-Methoxyacetophenon 28 und Acetophenon 30)7,20,48,49. Diese Duftstoffe wurden mit dem gesammelten OC-Schleim (eine Mischung aus gleichen Mengen aller Teilnehmer) gemischt und ihre Ethylacetatextrakte mittels GC/MS analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass der OC-Schleim die folgenden Stoffwechselvorgänge induziert: Hydrolyse der Ester unter Bildung von p-Kresol 2 (99 % als Gesamtionenchromatogramm (TIC) Peak-Häufigkeitsverhältnis des Metaboliten) und trans-2-Hexenol 16 (16 %); und Reduktion und Oxidation der Aldehyde unter Bildung von Benzylalkohol 24 (51 %), Octanol 26 (33 %) und Octansäure 27 (50 %; Abb. 3a – d, ergänzende Abb. 3a). Von den beiden Ketonen 2′-Hydroxyacetophenon 29 und Methylsalicylat 31 abgeleitete Metaboliten wurden jedoch nicht nachgewiesen, obwohl im OC50 über die Genexpression von CYPs berichtet wurde, die diese oxidieren.

Enzymatische Aktivität des Riechschleims. (a–d) Vermutete enzymatische Aktivität des Riechspaltschleims (OC) und Nachweis der daraus resultierenden Metaboliten. Geruchsstoffe wurden in Kochsalzlösung oder OC-Schleim inkubiert. Der Reaktant wurde mit Ethylacetat extrahiert und mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) analysiert. Die Intensität der Gesamtionen- oder extrahierten Ionenpeaks wurde auf eine Peakfläche von Ester 19 normalisiert, der keine durch OC-Schleim vermittelte Umwandlung durchlief. Graue und blaue Balken stellen normalisierte Gesamtionenintensitäten von 20.000 bzw. 2000 dar. Der gelbe Balken stellt eine extrahierte Ionenintensität von 50 dar. (e) Vergleich der enzymatischen Aktivität des OC-Schleims mit dem Schleim und Speichel des unteren Nasengangs (INM). Die Produktmengen bei jeder enzymatischen Umwandlung werden als normalisierte Werte dargestellt, wobei eine Spitzenfläche des Metaboliten im OC-Schleim auf 100 % eingestellt ist. (f) Individueller Unterschied in der enzymatischen Aktivität von OC-Schleim und dessen Zusammenhang mit der Proteinkonzentration. Die Esteraseaktivität von individuellem × 10 OC-Schleim wurde basierend auf einer Umwandlungsrate als [p-Kresol (mol)]/([pCA (mol)] + [p-Kresol (mol)]) 5 Minuten nach p-Kresylacetat bewertet ( pCA) wurde auf OC-Schleim aufgetragen (n = 29). (g) Zusammenhang zwischen Esteraseaktivität und Carboxylesterase 1 (CES-1)-Konzentration im OC-Schleim (n = 29). Grüne und magentafarbene Linien kennzeichnen Mittelwerte von INM- bzw. OC-Schleim. (h) Substratselektivität von OC-Schleim und CES-1. Rekombinantes CES-1 zeigte keine identische Reaktivität mit OC-Schleim. OC-Schleim zeigte unter CES-Inhibitoren (Bis(4-nitrophenyl)phosphat) eine Restaktivität, die CES-1 vollständig inhibierte. Die Variabilität der erfassten Peakfläche zwischen den Proben wurde unter Verwendung der Peakfläche des nicht metabolisierten Esters 19 korrigiert. (i) Zeitlicher Verlauf der Umwandlungsrate von pCA zu p-Kresol in × 10 verdünntem OC-Schleim oder CES-1-Lösung. Die Reaktion verlief bis zu 5 Minuten nach der Zugabe von pCA im zehnfach verdünnten OC-Schleim und bis zu 40 Minuten in der CES-1-Lösung linear. (j) Michaelis-Menten-Diagramm des pCA-Metabolismus in × 10 verdünntem OC-Schleim oder CES-1-Lösung. Verschiedene Konzentrationen von pCA wurden hinzugefügt und die Umwandlungsrate wurde zu jedem Zeitpunkt gemessen. ND, nicht erkannt.

Die bemerkenswerte Fähigkeit von OC-Schleim zur Hydrolyse von Estern veranlasste uns, die Struktur-Aktivitäts-Beziehung zu untersuchen. Ein zusätzliches Experiment wurde durchgeführt, um eine Reihe von Esterduftstoffen zu testen, mit pCA als Positivkontrolle (97 % als TIC-Peak-Häufigkeitsverhältnis des Metaboliten). Die Ergebnisse zeigten, dass der OC-Schleim Phenolester (2-Phenylethylacetat 3 [43 %], Anisylacetat 5 [8 %], Zimtacetat 7 [16 %]) und einen cycloaliphatischen Ester (L-Menthylacetat 9 [14 %]) umwandelte. ]) und aliphatische Ester (cis-3-Hexenylacetat 11 [19 %], Citronellylacetat 13 [25 %]; Abb. 3a). Im Gegensatz dazu wurden sterisch gehinderte Ester (Linalylacetat 17, Terpinylacetat 19 und Isobornylacetat 21) nicht umgesetzt. Der beobachtete Metabolismus wurde stärker durch den OC-Schleim induziert als durch INM-Schleim oder Speichel, was mit den höheren Konzentrationen gelöster Stoffe im OC-Schleim übereinstimmt (Abb. 3e, ergänzende Abb. 3b).

Als nächstes wurde die individuelle Variabilität der Esteraseaktivität von OC-Schleim analysiert, wobei der Schwerpunkt auf der Umwandlung von pCA in p-Kresol lag. Der Vergleich wurde basierend auf einer Umwandlungsrate von 5 Minuten durchgeführt, da die Reaktion bis zu 5 Minuten nach der Zugabe von pCA linear verlief (siehe Abb. 3i). Ein Teilnehmer wurde von dieser Analyse ausgeschlossen, da die gesammelte Schleimmenge nicht ausreichte. Die Umwandlungsraten (molares Verhältnis) unterschieden sich erheblich zwischen den Teilnehmern und lagen zwischen 5 und 45 %, mit einem Mittelwert von 18 %. Die Esteraseaktivität korrelierte negativ mit der Menge an OC-Schleim und positiv mit den Konzentrationen verschiedener Komponenten, wie z. B. Gesamtprotein (Abb. 3f, Ergänzungstabelle 1).

Es wurden auch die Moleküle untersucht, die eine hohe Esteraseaktivität im OC-Schleim verursachen. In einer früheren Studie an Nagetieren wurde vermutet, dass CES-1 zu dieser Reaktion beiträgt7. Ein Enzymimmunoassay (ELISA) zeigte, dass die CES-1-Konzentration im OC-Schleim höher war als im INM-Schleim oder Speichel (mittlere Konzentration: 5,73 μg/ml, 1,24 μg/ml und 0,06 μg/ml). bzw. Abb. 3g). Allerdings war CES-1 nicht vollständig für die Esteraseaktivität im OC-Schleim verantwortlich. Die CES-1-Konzentration im OC-Schleim war für eine geringere individuelle Varianz der Esteraseaktivität verantwortlich als die Konzentration der Gesamtproteine ​​(44 % vs. 53 %, Abb. 3f, g). Darüber hinaus zeigte der OC-Schleim andere Substratselektivitäten als die rekombinante CES-1-Lösung. Rekombinantes CES-1 stellte die Reaktivität des OC-Schleims gegenüber Anisylacetat 5 und Citronellylacetat 13 nicht wieder her (Abb. 3h). Darüber hinaus zeigte der OC-Schleim eine Restaktivität unter den CES-Inhibitoren Benzil und Bis(4-nitrophenyl)phosphat (BNPP), die durch eine gleiche Konzentration an rekombinantem CES-1 vermittelte Reaktionen vollständig inhibierten (Abb. 3h, ergänzende Abb. 3c). Schließlich zeigte eine Lösung mit einer äquivalenten Konzentration an rekombinantem CES-1 bei der Enzymkinetikanalyse eine geringere Reaktivität als OC-Schleim (Abb. 3i, j). Diese Ergebnisse deuteten auf das Vorhandensein eines oder mehrerer anderer Enzyme hin, die für die enzymatische Aktivität verantwortlich sind.

In einer früheren Studie wurde berichtet, dass eine geringe enzymatische Umwandlungsrate eines Geruchsstoffs im menschlichen Speichel die Geruchswahrnehmung leicht beeinflusst8. Wir stellten die Hypothese auf, dass die drastische Esteraseaktivität des OC-Schleims einen größeren Einfluss auf die Geruchswahrnehmung des Substrats hatte. Wir führten eine sensorische Studie unter Verwendung eines olfaktorischen Anpassungsparadigmas durch, das auf der vorherigen Studie8 basierte. Die olfaktorische Anpassung ist ein weithin bekanntes Phänomen der geruchsstoffspezifischen Verringerung der Empfindlichkeit nach längerer Exposition gegenüber einem identischen Geruchsstoff (Abb. 4a, b)51. Dementsprechend verringerte sich in der aktuellen Studie die olfaktorische Empfindlichkeit gegenüber p-Kresol nach vorheriger Exposition gegenüber p-Kresol, wohingegen sie nicht durch längeres Riechen von Muscone induziert wurde (Abb. 4c, d). Im Gegensatz dazu führte die Vorexposition von pCA zu einer signifikanten Verringerung der Wahrnehmungsintensität seines Metaboliten p-Kresol, was darauf hindeutet, dass pCA im OC-Schleim in p-Kresol umgewandelt wird. Eine alternative Erklärung für dieses Ergebnis ist, dass der Geruch von pCA eine Desensibilisierung des OR auslöste, die eine wichtige Rolle bei der Erkennung von p-Kresol spielt. Die Ergebnisse unserer In-vitro-Tests schlossen diese Möglichkeit jedoch aus. Unter den 378 getesteten menschlichen ORs, die in HEK293T-Zellen exprimiert wurden, erwies sich OR9Q2 als der empfindlichste Rezeptor für p-Kresol (Abb. 4e, ergänzende Abb. 4). Die anschließende funktionelle Charakterisierung zeigte, dass OR9Q2 gegenüber pCA nicht empfindlich war (Abb. 4f, g). Der Grund dafür, dass die Anpassung an pCA mit einer außergewöhnlichen Anpassung an p-Kresol einhergeht, liegt darin, dass die Umwandlung von pCA in p-Kresol in der Nasenhöhle erfolgt. Aufgrund fehlender Informationen über die Reaktionskinetik in vivo ist jedoch immer noch unklar, ob Menschen beim Schnüffeln von pCA eine Mischung aus der Metabolisierung von pCA und der Bildung von p-Kresol wahrnehmen.

Auswirkung der enzymatischen Umwandlung auf die Wahrnehmung. (a, b) Ein Modell, das die olfaktorische Anpassung an p-Kresol oder p-Kresylacetat (pCA) durch Aktivierung und Desensibilisierung einer bestimmten Untergruppe von Geruchsrezeptoren (ORs) zeigt. (c) Das experimentelle Anpassungsschema und die sensorische Bewertung. Jeder Proband bewertete die wahrgenommene Intensität der ersten und dritten Flasche, die beide mit p-Kresol gesättigte Wattebällchen enthielten. Die zweite Flasche enthielt einen Anpassungsreiz: destilliertes Wasser (kein Geruch), p-Kresol, Muscone oder pCA. Die Teilnehmer wurden gebeten, p-Kresol zu riechen und ihre wahrgenommene Intensität des Geruchs auf einer 95-mm-Skala aufzuzeichnen, die von „kein Geruch“ bis „starker Geruch“ reichte. (d) Änderung der wahrgenommenen Intensität von p-Kresol nach längerer Exposition mit jeder Testprobe (n = 8). Statistisch signifikante Veränderungen im Vergleich zu einer Kontrolle (kein Geruch) wurden durch eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit ungleicher Standardabweichung und den Mehrfachvergleichstest nach Holm-Sidak ermittelt. *, P = 0,0303; **, P = 0,0012. (e) Screening menschlicher ORs auf p-Kresol. Jeder der 378 entlang der x-Achse aufgeführten ORs wurde in HEK293T-Zellen exprimiert und mit p-Kresol (1 mM) stimuliert. OR-Aktivierungen wurden mithilfe eines CRE-regulierten Luciferase-Reportergen-Assays überwacht. Die y-Achse zeigt den fachen Anstieg der OR-Aktivität an, wenn ein Signal von stimulierten Zellen durch das von nicht stimulierten Zellen geteilt wird, die das gleiche OR exprimieren (Mittelwerte aus zwei Screening-Replikaten). (f, g) Calcium-Bildgebung der OR9Q2-Aktivierung. (f) Eine repräsentative Antwortspur reagierender Zellen. Die violetten vertikalen Linien um die Kurve stellen die Standardabweichung von 50 Zellen dar. Horizontale Linien über der Kurve zeigen die Dauer der Stimulationen mit 1 mM pCA und 0,3 mM p-Kresol an. (g) Anteil der reagierenden Zellen auf 0,3 mM oder 1,0 mM jedes Duftstoffs aus drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert ± Standardabweichung). (h) Dosis-Wirkungs-Kurve der transienten Rezeptorpotential-Melastatin-8-Aktivität (TRPM8) mit L-Menthol und L-Menthylacetat. Es wurde die vom Calciumioneneinstrom abhängige Fluoreszenz in TRPM8 gemessen, das stabil in HEK293T-Zellen exprimiert wird. Die Fluoreszenzintensität wurde mit 4 μM Ionomycin normalisiert. Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert ± Standardabweichung).

Ein Schnupfen dauert beim Menschen 1–2 s. Wir untersuchten, ob die Reaktionskinetik der enzymatischen Umwandlung schnell genug war, um die Wahrnehmung beim Schnüffeln zu beeinflussen. Da es schwierig ist, die Entstehung einer bestimmten Geruchsqualität zu bewerten, die nur durch ein mit einem Substrat vermischtes Produkt entsteht, wurde eine bekannte somatosensorische Wahrnehmung, d. h. Kühlung, als klarerer Index verwendet. Das Riechen von L-Menthol 10 oder seinem Acetat, L-Menthylacetat 9, löst ein kühlendes Gefühl aus, das eindeutig auswertbar ist52. Das Kühlgefühl wird höchstwahrscheinlich durch die Aktivierung des transienten Rezeptorpotentials Melastatin 8 (TRPM8) in somatosensorischen Neuronen verursacht53. Im Gegensatz zu L-Menthol 10 zeigte L-Menthylacetat 9 keine TRPM8-Aktivität (Abb. 4h). Diese Diskrepanz ist ein Beweis für das Vorhandensein einer OC-Schleimaktivität in vivo, die L-Menthylacetat 9 zu L-Menthol 10 metabolisiert, wie anhand von OC-Schleimproben nachgewiesen wurde (Abb. 3a). Noch wichtiger ist, dass dieses Ergebnis zeigt, dass die enzymatische Umwandlungsreaktion schnell genug ist, um die Geruchswahrnehmung beim Schnüffeln zu beeinflussen. Somit wird unser wahrnehmungsmäßiger Schnappschuss der chemischen Natur außerhalb der Nase durch den Geruchsschleim bearbeitet, bevor wir ihn wahrnehmen.

Im Allgemeinen nimmt die Geruchsempfindlichkeit mit zunehmendem Alter ab. Da wir jüngere Teilnehmer (Altersspanne: 20–67 Jahre) testeten als diejenigen in früheren Studien, die einen signifikanten altersbedingten Rückgang zeigten24,26, wurde kein negativer Zusammenhang zwischen Alter und olfaktorischer Empfindlichkeit gegenüber zwei Geruchsstoffen (PEA und tBM) festgestellt ( Ergänzende Abbildung 5). Im Gegensatz dazu ergab die aktuelle Studie eine altersabhängige Verringerung der Wahrnehmungsempfindlichkeit gegenüber Amb (rho = − 0,45, P < 0,05, Abb. 5a). Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass unsere OC-Schleimproben von einer Gruppe von Teilnehmern mit altersbedingtem Rückgang des Geruchssinns entnommen wurden. Daher war es möglich, aus den OC-Schleimproben einen Kandidatenfaktor zu identifizieren, der altersabhängige Veränderungen und eine verringerte Geruchsempfindlichkeit aufwies.

Zusammenhang zwischen dem Rückgang des Geruchssinns und der Veränderung des Riechspaltenschleims mit zunehmendem Alter. (a–f) Mit dem Alter verbundene Faktoren. Die x-Achse gibt das Alter der Teilnehmer an und die y-Achse stellt die Geruchsschwellenwerte für Ambrettolid (Amb; a, n = 28), die Menge an Riechspaltschleim (OC) (b, n = 30) und die Menge an minderwertigem Schleim dar Nasengangschleim (INM) (c, n = 30), Proteinkonzentration im OC-Schleim (d, n = 30), Umwandlungsrate von p-Kresylacetat (pCA) zu p-Kresol in × 10 verdünntem OC-Schleim (z , n = 29) und relative Headspace-Konzentration von Amb, das aus dem OC-Schleim emittiert wird (f, n = 28). (g) Grafische Zusammenfassung altersabhängiger Veränderungen des Geruchsschleims. Mit zunehmendem Alter nahm die Menge des OC-Schleims ab und die Konzentration der Bestandteile zu. (h) Experimentelles Verfahren zur Untersuchung der Aktivierung von olfaktorischen Rezeptor (OR)-exprimierenden Zellen, die mit unterschiedlichen Mengen Medium (0–50 μl) bedeckt sind und die altersabhängige Abnahme der Menge an OC-Schleim nachahmen. Mit Duftstoffen (100 μM) gesättigte Wattebällchen wurden über den Zellen in jeder Plattenvertiefung platziert. (i, j) Reaktion von cOR5A2- oder OR9Q2-exprimierenden Zellen auf Amb oder p-Kresol, das aus der Dampfphase diffundiert. Die Reaktion wurde mit der maximalen Reaktion im 50-μL-Zustand normalisiert. Jede Zeile zeigt die durchschnittliche Reaktion aus drei unabhängigen Experimenten. Die vertikalen Schattierungen stellen Standardfehler dar.

Es wurde vermutet, dass verschiedene altersbedingte Faktoren möglicherweise zu einem Rückgang der Geruchsempfindlichkeit führen10,27,28,29,30,31,33,34,35,37. Es gibt jedoch immer noch keine Beispiele für mechanische Erklärungen, die Veränderungen dieser Kandidatenfaktoren mit einer verminderten Geruchsempfindlichkeit in Verbindung bringen. Diese Studie fand neuartige altersabhängige Veränderungen. Die oben erwähnte individuelle Variabilität der OC-Schleimmenge korrelierte signifikant mit dem Alter (rho = 0,66, P <0,001, Abb. 5b). Ältere Teilnehmer zeigten eine um 60 % geringere Menge an OC-Schleim als jüngere Teilnehmer (Durchschnitt: 59,1 ± 21,0 mg bei Teilnehmern im Alter von 20 Jahren gegenüber 23,5 ± 10,6 mg bei Teilnehmern im Alter von 60 Jahren). Auch der INM-Schleim nahm altersabhängig ab (rho = – 0,35, P = 0,056) und funktionierte daher nicht mehr ausreichend, um den OC-Schleim zu befeuchten (Abb. 5c). Im Gegensatz dazu stiegen die Proteinkonzentration und die enzymatische Aktivität, was darauf hindeutet, dass die verringerten Mengen an OC-Schleim durch einen Rückgang des Wassergehalts verursacht wurden (Abb. 5d, e). Trotz des alterungsbedingten Anstiegs der Konzentrationen der Gesamtproteine ​​im OC-Schleim war die Einfangaktivität für Amb nicht erhöht (Abb. 5f), was wahrscheinlich auf eine spezifische Abnahme der mutmaßlichen OBPs und/oder das Vorhandensein anderer unbekannter Faktoren zurückzuführen ist ), die mit der Aktivität verknüpft sind10.

Der Anstieg der Konzentrationen gelöster Stoffe und der enzymatischen Aktivität mit zunehmendem Alter könnte die Beeinträchtigung der Fähigkeit zur Geruchserkennung gegenüber einem begrenzten Bereich von Geruchsstoffen wie Schwefel und Estern erklären. Dies erklärt jedoch nicht die Beeinträchtigung der Geruchsempfindlichkeit gegenüber Amb (Abb. 5a) und anderen allgemeinen Geruchsstoffen. Stattdessen ist eine Verringerung der Menge des OC-Schleims wahrscheinlicher für den Rückgang der olfaktorischen Empfindlichkeit gegenüber allgemeinen Geruchsstoffen aufgrund einer durch Dehydrierung verursachten Schädigung der Lipiddoppelschicht von OSNs und einer Verzerrung der OR-Strukturen. Dies steht im Einklang mit früheren Studien. Eine Studie zeigte, dass eine verringerte Menge an Riechschleim bei Mäusen die Geruchsempfindlichkeit verringerte54. In einer anderen Studie wurde berichtet, dass eine Erhöhung der Schleimmenge bei neugeborenen Kaninchen zu einer erhöhten Geruchsempfindlichkeit führte16.

Die aktuelle Studie stellte den Effekt einer Verringerung der Menge an OC-Schleim auf die OR-Aktivierung als Reaktion auf Geruchsstoffe wieder her (Abb. 5g, h). Im Gegensatz zu einer großen Anzahl früherer Studien, in denen Geruchsstoffe in der flüssigen Phase stimuliert wurden8,15,19,41, wurde HEK293T-Zellen, die jedes OR exprimierten, ein Geruchsstoff in der Dampfphase präsentiert, was es uns ermöglichte, die OR-Aktivierung unter praktischeren Bedingungen zu bewerten . Ein mit einer Duftstofflösung getränkter Wattebausch wurde über den Zellen in jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen platziert (Abb. 5h). Aus dem Wattebausch verflüchtigte Geruchsstoffe gelangten über das Medium zu den OR-exprimierenden Zellen und ihre Reaktionen wurden mit Echtzeit-GloSensor™ überwacht. Es wurde eine Stimulation in der Dampfphase beobachtet, wie aus der Feststellung hervorgeht, dass keine Reaktion beobachtet wurde, wenn ein nichtflüchtiges Zellstimulans (z. B. Forskolin) getestet wurde. Die Aktivierungen einer Konsensversion von OR5A2 (im Folgenden cOR5A2) und OR9Q2 gegen die Dampfphase von Amb und p-Kresol wurden überwacht55. Das Ergebnis zeigte, dass ein geringes Volumen an Medium, das OR-exprimierende Zellen bedeckt, eine geringere maximale Reaktion verursachte; Eine Reduzierung der Mediummenge um 60 % (von 50 auf 20 μl) verringerte die Antwortamplitude von cOR5A2 und OR9Q2 auf 33 % bzw. 35 % (Abb. 5i, j). Dieses Experiment konnte die physikalischen und biochemischen Eigenschaften von OC-Schleim nicht wiederherstellen. Die erhebliche Toxizität des OC-Schleims gegenüber HEK293T-Zellen erschwerte das Experiment unter physiologischeren Bedingungen. Daher können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass Unterschiede in der OC-Schleimmenge zu unterschiedlichen Auswirkungen auf die OR-Aktivierung führten. Dennoch ist dies die erste Studie, die einen ursächlichen Faktor für den altersabhängigen Rückgang der Geruchsempfindlichkeit mit einer möglichen mechanistischen Erklärung vorschlägt.

In der vorliegenden Studie wurden die Eigenschaften des menschlichen OC-Schleims ausführlich beschrieben. OC-Schleim enthält höhere Konzentrationen an gelösten Stoffen, einschließlich Gesamtproteinen, anorganischen Elementen und Glutathion, als andere Körperflüssigkeiten. Unsere Funktionsanalysen liefern Schlussfolgerungen zu den zuvor vorgeschlagenen Funktionen von OC-Schleim und seinem Beitrag zur Geruchswahrnehmung. OC-Schleim weist eine bemerkenswerte Fähigkeit auf, Geruchsstoffe einzufangen, dies erklärt jedoch nicht die Wahrnehmungsempfindlichkeit gegenüber einem Geruchsstoff. Darüber hinaus ergab die aktuelle Studie, dass der Geruchsstoffstoffwechsel im OC-Schleim an der Wahrnehmung beteiligt ist. Schließlich zeigen die vorliegenden Ergebnisse einen altersabhängigen Rückgang der Menge an OC-Schleim als mögliche Ursache für den altersbedingten Rückgang der Geruchsempfindlichkeit.

Diese Studie enthüllte die Konzentrationen gelöster Stoffe im OC-Schleim und ihre individuelle Variabilität. Unsere Ergebnisse liefern wesentliche Informationen, die frühere Auswirkungen der OC-Schleimfunktionen erklären, wie z. B. die Fähigkeit zur Bindung von Geruchsstoffen, einen hohen xenobiotischen Metabolismus und eine Cu-vermittelte Geruchserkennung9,41,43. Darüber hinaus ermöglichen die vorliegenden Daten zusammen mit der zuvor berichteten Proteinzusammensetzung die Rekonstitution von OC-Schleim und helfen bei der Untersuchung der funktionellen Bedeutung der entstehenden Eigenschaften, einschließlich Zn als D-Block-Element und als geschlechtsspezifisches Merkmal56,57. Die angenommenen Funktionen des OC-Schleims beschränken sich nicht nur auf die Geruchswahrnehmung, sondern umfassen auch den Schutz von OSNs vor schädlichen Verbindungen und die Vorbeugung von Infektionen. Die offengelegten Rohdaten werden eine Grundlage für zukünftige Studien bilden, um die Funktionen des Geruchsschleims aus mehreren Perspektiven zu verstehen (Ergänzungstabelle 1).

Die am häufigsten angenommene Funktion von OC-Schleim ist der Transport und die Konzentration von Geruchsstoffen über OBPs. Tatsächlich wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie die potenzielle Funktion eines menschlichen OBP bei der Erkennung von Geruchsstoffen durch OPs getestet; Sie testeten jedoch ein künstlich hergestelltes OBP ohne Liganden. Daher blieb die Frage unbeantwortet, ob OC-Schleim die Fähigkeit besitzt, Geruchsstoffe einzufangen und deren Wahrnehmung zu fördern. Unsere In-vitro- und In-vivo-Experimente kamen zu dem Schluss, dass OC-Schleim eine drastische Fähigkeit zur Geruchsstoffbindung aufweist; Sie erklärten jedoch nicht die individuelle Varianz der Geruchsempfindlichkeit. Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen eines Insektenmodells, das mit vergleichbarer Empfindlichkeit auf Geruchsstoffe reagieren kann, wenn alle OBP-Gene gelöscht sind58. Wir spekulieren, dass die Geruchsstoff-einfangende Aktivität von OC-Schleim zur schnellen Entfernung von Geruchsstoffen aus der Mikroumgebung von OSNs beitragen kann, um die Erholung nach längerer Anpassung sicherzustellen und Schäden durch die Ansammlung schädlicher Substanzen zu verhindern59.

Diese Studie ergab anhand einer kinetischen Analyse verschiedene hohe xenobiotische Metabolisierungen von OC-Schleim. Zwei aktuelle Studien haben über die enzymatischen Aktivitäten von aus menschlichem OC-Schleim gewonnenen Proben gegen ausgewählte Geruchsstoffe berichtet8,14; Allerdings wurden in diesen Studien die Proben unter künstlichen Bedingungen ausgewertet. In einer Studie wurde OC-Schleim als Kochsalzlösung aus einer gespülten Nasenhöhle gewonnen, was wahrscheinlich zu einer Verdünnung und dem Einschluss von Verunreinigungen aus umliegenden Regionen führte, wie z. B. Schleim aus dem unteren Nasengang (INM)8. Tatsächlich wurde in dieser Studie keine relativ höhere enzymatische Aktivität von OC-Schleim festgestellt. In einer anderen Studie wurde OC-Schleim direkt gesammelt, eine Aldehydreduktion wurde jedoch nur in verdünntem OC-Schleim, der mit Coenzymen ergänzt war, festgestellt14. In der aktuellen Studie wurde OC-Schleim ohne Verdünnung oder Behandlung getestet und seine Aktivität gegenüber einem breiteren Spektrum von Geruchsstoffen untersucht. Bemerkenswert ist, dass individuelle Unterschiede in der enzymatischen Aktivität auf der Grundlage der Reaktionskinetik ermittelt wurden, was genauere Informationen liefert als ein zuvor berichteter Vergleich auf der Grundlage von Endpunktmessungen8,14. Unsere Ergebnisse zeigten, dass intakter OC-Schleim eine hervorragende Fähigkeit zur Geruchsumwandlung besitzt. Wir stellen fest, dass die geringere Kapazität von INM-Schleim pro Masseneinheit im Vergleich zu OC-Schleim wahrscheinlich einen erheblichen Beitrag zur Wahrnehmung leistet, da INM-Schleim eine größere Oberfläche für die enzymatische Umwandlung inhalierter Geruchsstoffe bietet. Diese Kapazitätsklärung ermöglicht möglicherweise die Entwicklung eines Pro-Geruchsstoffs, der einen OR erst aktiviert, nachdem ein ausreichender Grad an enzymatischer Umwandlung erreicht wurde.

Das wichtigste Ergebnis dieser Studie war eine altersabhängige Abnahme der Menge an OC-Schleim. In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen haben frühere Studien gezeigt, dass das Altern zu Störungen der Wasserhomöostase führt und zu einer Verdünnung des Schleims mit einer verschlechterten Funktion in anderen Geweben führt60,61,62. In der Nasenhöhle wurde eine altersbedingte Degeneration der Bowman-Drüsen und der Schleimsekretion beobachtet28. Die Abnahme des Wassergehalts und die Zunahme der Konzentrationen gelöster Stoffe verursachen wahrscheinlich nicht nur eine durch Trockenheit verursachte Dysfunktion der OSNs, sondern führen auch zu einem Anstieg der Viskosität der Schleimschicht. Dies verringert die Diffusionsgeschwindigkeit absorbierter Geruchsstoffe und verschlechtert folglich die Erkennungseffizienz von Geruchsstoffmolekülen durch OSNs. Es ist bekannt, dass eine Erhöhung der Schleimkonzentration (d. h. Dehydrierung) die Geschwindigkeit des Schleimflusses verringert und Substanzen, einschließlich Geruchsstoffe, entfernt63,64. Die langsamere Entfernung und das verringerte Schleimvolumen können synergistisch die Ansammlung schädlicher flüchtiger Stoffe und infektiöser Mikroorganismen erhöhen, was das Neuroepithel und die Bowman-Drüsen beeinträchtigt und zu einer Beschleunigung der Seneszenz führt. Die vorliegenden Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Rückgewinnung von Wasser im OC-Schleim eine wirksame Behandlung für olfaktorische Dysfunktion sein könnte, eine Ursache für eine beeinträchtigte Lebensqualität bei älteren Menschen.

Die Teilnehmer wurden durch Schneeball-Probenahme rekrutiert und entlohnt. An der Studie nahmen 30 japanische Erwachsene im Alter zwischen 20 und 60 Jahren teil. Die Teilnehmer hatten aufgrund ihrer Anamnese oder einer Nasenendoskopie keine subjektiven oder objektiven Hinweise auf eine Entzündung der Nasennebenhöhlen. Schwangere wurden ausgeschlossen. Das Studienprotokoll wurde von den Ethikkommissionen der Kao Corporation und des Edogawa Hospital genehmigt (Genehmigungsnummer: T141-180620) und wurde gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Alle Teilnehmer gaben ihre Einverständniserklärung ab.

Die Geruchsschwellen für drei Verbindungen (PEA, Amb und tBM) wurden gemessen. Die Kaufquellen der Geruchsstoffe sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Sensorische Schwellenwerte wurden unter Verwendung von mit geruchlosem Mineralöl verdünnten Geruchsstoffen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) unter Verwendung eines Drei-Alternativen-Forced-Choice-Verfahrens ermittelt. Die höchsten Konzentrationen an Duftstofflösungen waren wie folgt: PEA bei 1000 ppm; Amb bei 10.000 ppm; und tBM bei 1 ppm. Sie wurden 15-fach zweifach verdünnt, um 16 Verdünnungen jedes Duftstoffs herzustellen. In jedem Versuch wurden den Teilnehmern drei Flaschensätze in zufälliger Reihenfolge vorgelegt: Ein Satz enthielt den Duftstoffreiz, die anderen enthielten nur das Verdünnungsmittel (Leerproben). Nachdem die Teilnehmer nacheinander an jedem Set gerochen hatten, wurden sie gebeten, die geruchshaltige Flasche zu identifizieren. Es war keine Anerkennung oder Qualitätsidentifizierung erforderlich. Für jeden Fehlnachweis wurde die nächstniedrigere Konzentration angegeben. Der erste Versuch begann mit der niedrigsten Konzentration und bei zwei aufeinanderfolgenden korrekten Nachweisen wurde im zweiten Versuch eine viermal höhere Konzentration vorgelegt. Bei zwei aufeinanderfolgenden korrekten Nachweisen im zweiten Versuch wurde die nächsthöhere Konzentration angegeben, bis der Geruchsstoff korrekt identifiziert wurde. Wenn im zweiten Versuch die erste Duftstoffkonzentration nicht identifiziert werden konnte, wurde die nächstniedrigere Konzentration angegeben. Als Schwellenwert wurden die durchschnittlichen Konzentrationen des ersten und letzten korrekten Nachweises ermittelt. Die Konzentrationen wurden als Verdünnungszeiten der Lösungen (15–0) angegeben. Der Nachweis der niedrigsten Konzentration wurde mit 15 und der Fehlnachweis der höchsten Konzentration mit 0 bewertet. Bei den Schwellenwerttests für zwei Teilnehmer gab es einen Fehler im Protokoll, weshalb ihre Schwellenwerte ausgeschlossen wurden.

Der gesamte Speichel wurde direkt in einem Plastikröhrchen gesammelt, nachdem der Mund mit Wasser gespült wurde. Die Probe wurde zentrifugiert (10 Minuten lang bei 10.000 U/min) und bei –80 °C eingefroren, bis sie benötigt wurde. Der gesamte Speichel wurde am selben Tag wie der Geruchsschwellentest gesammelt und der Geruchsschleim wurde 1–3 Wochen später im Edogawa-Krankenhaus gesammelt. Schleimproben wurden mit neurochirurgischen Pads (BEMSHEETS XR, 0,7 × 0,7 cm; KAWAMOTO Corporation, Osaka, Japan) gesammelt. Das Kissen konnte maximal etwa 150 mg Wasser aufnehmen, und die Menge des gesamten gesammelten Schleims lag unter 150 mg. Die Pads wurden dann in ein Röhrchen gelegt, in dessen Boden mit einer 20-Gauge-Nadel ein Loch gebohrt wurde. Ein weiteres Röhrchen wurde unter das durchstochene Röhrchen gestellt und zentrifugiert (10.000 U/min für 10 Minuten). Das gesammelte Nasensekret wurde bis zur Verwendung bei −80 °C eingefroren. Bei einem Probanden wurde weder aus der linken noch aus der rechten Nasenhöhle INM-Schleim gesammelt. Bei einem Probanden fiel das auf dem linken INM platzierte Pad während der Entnahme in den Mund. Für alle Analysen wurde nur der aus der rechten Nasenhöhle gesammelte INM-Schleim verwendet. Riechschleim wurde 5 Tage lang gesammelt (6 Teilnehmer/Tag). In dieser Zeit war das Wetter an einem Tag sonnig und an den anderen Tagen regnerisch.

Die Proteinkonzentrationen wurden mithilfe des BCA-Proteintests mit BSA als Standard bestimmt. Die Konzentrationen von CES-1 wurden unter Verwendung eines CES-1 ELISA-Kits (RayBiotech; Peachtree Corners, GA, USA) bestimmt. Die Glutathionkonzentrationen wurden unter Verwendung eines GSSG/GSH-Quantifizierungskits (DOJINDO, Kumamoto, Japan) bestimmt. Gleiche Schleimmengen, die von der linken und rechten Seite gesammelt wurden, wurden gemischt und analysiert, mit Ausnahme einer INM-Schleimprobe, wie zuvor beschrieben.

N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP; Kishida Chemical Co., Ltd., Osaka, Japan; für die Elektronikindustrie) und Salpetersäure 1,38 (60 %; Kanto Chemical Co., Inc., Tokio, Japan; für die Elektronikindustrie). Industrie) wurden zur Herstellung der Kalibrierkurvenlösung und Probenverdünnung verwendet. Als Standardlösung für die Kalibrierungskurve wurde SPEX CertiPrep (XSTC-13 elementare gemischte Standardlösung, 10 μg/ml, 5 % HNO3; SPEX, Metuchen, NJ, USA) verwendet. Eine Mischung aus 5 μl OC-Schleim und INM-Schleim (linke und rechte Mischung) oder 100 μl Speichelüberstand wurde in 5 ml 1 % salpetersäurehaltigem NMP gelöst. Automatische Messungen wurden mit einem induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometer (ICP-MS) iCAP Qs von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) durchgeführt, das mit dem automatischen Messsammler ESI SC2 DX verbunden war und von der Software Qtegra gesteuert wurde. Eine mit 1 % salpetersäurehaltigem NMP verdünnte Probe wurde durch Selbstansaugung direkt in eine auf 4 °C eingestellte Quarzzyklonkammer eingeführt. Um die Ansammlung von Kohlenstoff zu verhindern, wurde Sauerstoff in das Plasma eingebracht. Für die Zn-Messung wurden Kollisionsbedingungen mit Heliumgas angewendet. Auf alle Elemente außer Zn wurden Kaltplasma- und 1% NH3-He-Gaskollisionsreaktionsbedingungen angewendet (Ergänzungstabelle 3).

Die Kalibrierungskurve wurde mit einer 1 %igen, mit Salpetersäure versetzten NMP-Lösung in Konzentrationen von 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 5, 10, 50 und 100 ng/ml erstellt. Für alle Elemente wurde eine Linearität (r > 0,999) erhalten, und die untere Quantifizierungsgrenze der injizierten Probe wurde mit 0,1 ng/g bestätigt (100 ppb für OC- und INM-Schleim, 5 ppb für Speichel). Die Proben waren zu konzentriert, um die Na-, K- und Ca-Konzentrationen zu bestimmen; Daher wurden Standardkurven im Bereich von 0,1 ppb bis 100 ppb für Mg und 0,1–10 ppb für die anderen erstellt. Blindproben wurden durch Einweichen neurochirurgischer Pads in Milli-Q-Wasser und anschließendes Sammeln des Wassers als Geruchsschleim hergestellt. Die Konzentrationen von Mg, Fe, Cu und Zn in den Schleim- oder Speichelproben waren höher als in den Blindproben. Die Fe-Konzentration einer OC-Schleimprobe war höher als die der anderen (~ 40 ppm, während der Durchschnitt der anderen 1,67 ppm betrug). Diese Probe könnte eine kleine Menge Blut enthalten haben; Daher wurden die ICP-MS-Daten dieser Probe von den Analysen ausgeschlossen.

Die für pigOBP kodierende DNA wurde mithilfe von GenScript-Gensynthesediensten (GenScript Biotech Corp., Piscataway, NJ, USA) synthetisiert. Das synthetisierte Gen hat im Grunde die gleiche Sequenz wie NM_213796.1; Es kodiert jedoch Proteine, die die F88W-Mutation46 und den His6-Tag am C-Terminus tragen, aber ohne die 15-Aminosäuren-Sequenz, die eine Signalpeptidsequenz am N-Terminus kodiert. Das synthetisierte Gen wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI verdaut und in pET-22b (Merck Biosciences, Madison, WI, USA) kloniert. Dies führte zum endgültigen Expressionsvektor, der pigOBP mit einer N-terminalen pelB-Leadersequenz kodierte. pigOBP wurde durch GenScript unter Verwendung des Escherichia coli-Stammes BL21(DE3) und einer Ni-Säule exprimiert und gereinigt. Die Konzentration wurde mithilfe des Bradford-Protein-Assays mit BSA als Standard bestimmt. pigOBP wurde mithilfe von Maus-Anti-His-mAb (GenScript) in der Western-Blot-Analyse nachgewiesen.

Die Messungen wurden wie zuvor beschrieben46 durchgeführt. Duftstofflösungen (Amb, L-Menthon und Citronellol) wurden als 100 mM Stammlösungen in EtOH hergestellt. 1-AMA (Accu Standard Inc., New Haven, CT, USA) wurde als 1 mM Stammlösung in EtOH hergestellt. pigOBP wurde als 60 μM Stammlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung hergestellt. Stammlösungen wurden eingefroren und dann für die Tests mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) verdünnt. Wir gaben 50 µL der getesteten Lösung in eine schwarze Platte mit 96 Vertiefungen (Corning Inc., Corning, NY, USA). Die Fluoreszenzemission der Lösungen wurde auf einem EnSight Multimode Plate Reader (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) aufgezeichnet.

Die Duftstoffmischungslösung (40 μl), die Amb, L-Menthon und Citronellol enthielt, wurde in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) mit oder ohne verschiedene Konzentrationen von pigOBP hergestellt. Die Lösung wurde dann in ein 2-ml-Headspace-Fläschchen (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) pipettiert, mit einem Septum-Schraubdeckel aus Polytetrafluorethylen (PTFE)/Silikon verschlossen und 5 Minuten lang in einem Wasserbad auf 37 °C erhitzt Bad, um die SPME-Faser (Polydimethylsiloxan [PDMS]/Divinylbenzol [DVB], df 65 μm, SUPELCO, Inc., Bellefonte, PA, USA) 30 Minuten lang dem Kopfraum des Fläschchens auszusetzen. Die SPME-Geräte wurden vor der Probenahme konditioniert. Es wurde ein Gaschromatograph Agilent 7890A verwendet, der mit einem massenselektiven Detektor Agilent 5975C (Agilent Technologies) verbunden war. Die für GC/MS verwendete analytische Säule war eine DB-WAX-Säule für Amine (60 m × 0,25 mm ID, GL Sciences, Tokio, Japan). Als Trägergas wurde Helium (99,99995 %) im Konstantdruckmodus (56,07 kPa) verwendet. Die Injektortemperatur (Desorption) betrug 250 °C. Die SPME-Faser wurde im spitless-Modus desorbiert und die Desorptionszeit betrug 1 Minute. Das Ofentemperaturprogramm reichte von 40 °C (4 Min.) bis 240 °C bei 6 °C/Min. Im MS wurde Elektronenionisation mit einem Scanbereich von 35–300 m/z verwendet. Die Temperatur der Ionenquelle wurde bei 230 °C gehalten.

Eine Duftstoffmischungslösung (0,2 μl), die in Ethanol gelöstes Amb, Muscone und PEA enthielt, wurde zu 20 μl Kochsalzlösung, BSA-Lösung, Riechschleim, denaturiertem OC-Schleim und Speichel in einem 2-ml-Headspace-Fläschchen (Agilent Technologies) gegeben. Dieser wurde sofort mit einem PTFE/Silikon-Septum-Schraubverschluss verschlossen. Die Geruchsstoffe im Kopfraum wurden mithilfe von SPME GC/MS wie zuvor beschrieben analysiert. Die GC/MS-Analysesäule war eine VF-WAXms-Säule (30 m × 0,25 mm ID, Agilent Technologies). Die Peakfläche des extrahierten Ionenchromatogramms (EIC) der Geruchsstoffe (m/z = 252 für Amb, 238 für Muscone und 91 für PEA) wurde entsprechend der Ethanol-EIC-Peakfläche (m/z = 45) unter den Proben angepasst. Nach der Extraktion mit SPME wurde die wässrige Lösung mit Wasser (80 μL) verdünnt und Ethylacetat (100 μL) zugegeben. Die Lösung wurde verwirbelt, um restliche Geruchsstoffe aus der organischen Schicht zu extrahieren. Die organische Schicht wurde mittels GC/MS analysiert. Die injizierte Probe betrug im Split-Modus (10:1) 1 μL.

CES-1-Inhibitoren (BNPP und Benzil) und rekombinantes CES-1 wurden von TCI (Tokio, Japan) bzw. R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) bezogen. Für enzymatische Reaktionen wurden Duftstoffmischungen (0,2 μl, 10 mM in Ethanol) zu 20 μl Kochsalzlösung, Speichel, INM-Schleim, OC-Schleim, verdünnten Proben (mit Kochsalzlösung) und CES-1-Lösungen (50 mM Tris-HCl, pH 7,5) mit oder ohne CES-1-Inhibitoren (wässrige Lösung für BNPP und Dimethylsulfoxid [DMSO]-Lösung für Benzil, 100 μM bei Endkonzentration). Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und dann mit 80 μl Wasser verdünnt. Der Lösung wurde Ethylacetat (100 μl) zugesetzt: Die zweiphasige Lösung wurde verwirbelt, um Geruchsstoffe und Metaboliten zu extrahieren. Die organische Schicht wurde gesammelt und mithilfe von GC/MS wie zuvor beschrieben analysiert. Die Konzentrationen wurden anhand der Fläche des EIC-Peaks bestimmt. Bei der Analyse der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen mit verschiedenen Acetaten blieb die Peakfläche des Esters 19 über die Experimente nahezu unverändert und der entsprechende Alkohol wurde nicht nachgewiesen. Daher wurde die Peakfläche zwischen den Experimenten anhand der Peakfläche angepasst.

Um den zeitlichen Verlauf der enzymatischen Reaktion von pCA zu bestimmen, wurden 1,6 μl pCA (10 mM in Ethanol) zu 160 μl × 10 verdünntem OC-Schleim, CES-1-Lösung (0,57 μg/ml) und Vehikeln hinzugefügt. Dann wurden 20 μl der Reaktionslösung 0, 1, 5, 10, 20, 40, 60 und 120 Minuten nach der Zugabe von pCA gesammelt, bei 37 °C inkubiert und einer GC/MS unterzogen. Um den Michaelis-Menten-Wert zu bestimmen, wurde pCA dem verdünnten OC-Schleim oder der CES-1-Lösung in Endkonzentrationen von 50, 100, 250, 500 und 1000 μM zugesetzt. Die Reaktionslösungen wurden 5 Minuten (verdünnter OC-Schleim) bzw. 40 Minuten (CES-1-Lösung) bei 37 °C inkubiert und die Reaktionsgeschwindigkeiten mittels GC/MS-Analyse bestimmt. Die Michaelis-Menten-Werte Vmax und Km wurden mit der GraphPad Prism-Software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) berechnet. pCA (Endkonzentration = 100 μM) wurde verwendet, um die enzymatische Reaktivität einzelner OC-Schleimproben zu bestimmen (Inkubationszeit = 5 Minuten).

pCA wurde als 0,1 %ige Mineralöllösung hergestellt. Die p-Kresol-Konzentration betrug 0,001 % in destilliertem Wasser. Die Duftstofflösungen (1 ml) wurden in 110-ml-Glasfläschchen gegeben. Muscone wurde direkt auf sterilisierte Wattebällchen (1,0 mg) in einem Fläschchen aufgetragen. Die Fläschchen wurden offen gelassen, um den Kopfraum auszugleichen. Die Anzahl der Teilnehmer mit dem OR9Q2-Genotyp wurde nicht ermittelt, da keine Missense-Varianten gemeldet wurden. Acht Teilnehmer wurden gebeten, p-Kresol zu riechen, und die wahrgenommene Intensität des Geruchs wurde auf einer 95-mm-Skala aufgezeichnet, die von „kein Geruch“ bis „starker Geruch“ reichte. Anschließend erhielten sie eine Probe (Wasser, p-Kresol, Muscon oder pCA) und wurden gebeten, 2 Minuten lang zu inhalieren. p-Kresol wurde erneut in einem anderen Fläschchen präsentiert und die Teilnehmer wurden gebeten, die wahrgenommene Intensität des Geruchs erneut zu bewerten. Die Intensitätsänderung wurde wie folgt berechnet: Die Werte vor der Desensibilisierung wurden auf 100 % normalisiert und dann mit den Werten nach der Desensibilisierung verglichen. Die Einstufung ergab entweder einen positiven Wert (erhöhte Intensität von p-Kresol nach Desensibilisierung) oder einen negativen Wert (verringerte Intensität von p-Kresol nach Desensibilisierung) bis zu einem Minimum von −100 (kein wahrgenommener Geruch nach Desensibilisierung). In jedem Test wurden zwei separate Versuche mit demselben Duftstoff als Probe A präsentiert. Die zu unterschiedlichen Zeitpunkten präsentierten Teilnehmerbewertungen von p-Kresol wurden verglichen, um die Zuverlässigkeit zu bestimmen. Wenn der Unterschied zwischen den Rankings > 30 % betrug, wurde die Bewertung als unzuverlässig erachtet und die Intensitätsrankings wurden willkürlich vergeben. Die Ergebnisse wurden dann aus der Analyse ausgeschlossen. Den Teilnehmern wurde zwischen jedem Versuch eine 10-minütige Pause eingeräumt, um die Auswirkungen der Desensibilisierung umzukehren.

Der Dual-Glo™-Luciferase-Assay (Promega, Madison, WI, USA) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt55. Kurz gesagt, FLAG-Rho-markiertes OR, cAMP-Response-Element (CRE)/luc2PpGL4.29, pRL-CMV und RTP1S wurden zu Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit Polyethylenimin Max (PEI-MAX, Polysciences, Warrington, PA, USA) hinzugefügt. USA) für jedes Well einer Poly-D-Lysin-beschichteten 96-Well-Platte (Corning) oder Poly-D-Lysin-beschichteten 384-Well-Platte (Corning). Nach 15-minütiger Inkubation wurde die Zellsuspension zur Transfektionslösung gegeben. Nach 24-stündiger Transfektion wurde das Medium entfernt und die transfizierten Zellen mit einer in DMEM verdünnten Duftstofflösung stimuliert. Die Platten mit 96 und 384 Vertiefungen wurden versiegelt und 3–4 Stunden lang bei 37 °C und anschließend mit Luciferase inkubiert Reportergenaktivitäten wurden gemessen. Die durch Duftstoffe induzierte Aktivität wurde als CRE:Luc-Verhältnis (Lumineszenzintensität der Firefly-Luciferase dividiert durch die von Renilla-Luciferase) oder als fache Steigerung (Luc(N) dividiert durch Luc(0)) berechnet. Luc(N) war das CRE:Luc-Verhältnis einer bestimmten, mit Duftstoffen stimulierten Vertiefung, und Luc(0) war das CRE:Luk-Verhältnis einer bestimmten, nicht stimulierten Vertiefung. Die Datenanalyse wurde mit der Software Microsoft Excel oder GraphPad Prism durchgeführt.

Das Experiment wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt65. Die Zellen wurden auf 35-mm-Schalen mit Glasboden (Iwaki Inc., Chiba, Japan) ausgesät, die mit Poly-D-Lysin beschichtet waren. Anschließend wurden die Zellen mit Rho-OR9Q2, Gα15 und RTP1S mit PEI-MAX transfiziert. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die mit Fura-2/AM beladenen Zellen dann mit Ringer-Lösung (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Glucose und 10 mM HEPES [pH 7,4]) gewaschen. und einer Kalziumbildgebung unterzogen. Eine Reihe von Duftstoffen in Ringer-Lösung wurde nacheinander mit einer peristaltischen Pumpe mit einer Flussrate von 2,0 ml/min auf die Zellen aufgetragen. Intrazelluläre Ca2+-Spiegel wurden als Fura-2/AM-Fluoreszenz bei 510 nm durch Anregung bei 340 oder 380 nm unter Verwendung von AQUA COSMOS (Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japan) nachgewiesen.

Das GloSensor™ cAMP Assay System (Promega, Madison, WI, USA) bewertete die Auswirkung eines mittleren Volumens auf Echtzeit-OR-Reaktionen auf die Dampfphase von Geruchsstoffen (Amb oder p-Kresol). HEK293T-Zellen wurden mit 30 ng/Well RTP1S-Plasmid, 67,5 ng/Well OR9Q2-Plasmid oder 30 ng/Well cOR5A2-Plasmid und 67,5 ng/Well 20F-Plasmid (Promega) auf einer 96-Well-Schwarzplatte (Corning, Glendale, AZ) transfiziert , USA). 24–40 Stunden nach der Transfektion wurde DMEM (Thermo Fisher Scientific) durch 50 μl CO2-unabhängiges Medium (Thermo Fisher Scientific) ersetzt, das 4 % GloSensor cAMP-Reagenz (Promega) enthielt. Nach 2-stündiger Äquilibrierung bei 37 °C wurde das Volumen des Mediums in Schritten von 10 μL von 0 auf 50 μL angepasst. Unmittelbar danach wurde in jeder Vertiefung ein 7 mm großer Wattebausch (Osaki Medical, Nagoya, Japan) über dem Medium platziert. Die Platte wurde in ein funktionelles Arzneimittel-Screening-System (FDSS)/µCELL (HAMAMATSU Photonics, Shizuoka, Japan) geladen. Nach 20-minütiger Äquilibrierung bei 37 °C wurden automatisch 150 μl wässrige Duftstofflösung mit 50 μl/s auf jeden Wattebausch aufgetragen. Die Zelllumineszenz wurde 60 Minuten lang in 5-s-Intervallen gemessen. Zu jedem Zeitpunkt wurde ein roher Lumineszenzwert von durch Duftstoffe stimulierten Zellen von einem Wert von nicht stimulierten Zellen abgezogen. Das Verhältnis des einzelnen subtrahierten Werts zum Maximalwert im 50-μL-Zustand wurde als normalisierte Reaktion (%) definiert.

Calciumeinstromtests wurden mit einem FDSS/µCELL durchgeführt. Die Zellen, in denen TRPM8 stabil exprimiert wurde, wurden wie zuvor beschrieben erhalten66. Die Zellen wurden in mit Poly-D-Lysin beschichteten 96-Well-Platten (Corning) mit 20.000 Zellen/Well ausgesät und über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden dann mit Ringer-Lösung, ergänzt mit 2 µM Fluo4-AM, 0,5 mM Probenecid und 0,01 % Pluronic F-127, 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden einmal gewaschen und mit dem Testpuffer gewonnen. Anschließend wurden die Platten in das FDSS eingesetzt und die Zellen und Testproben 5 Minuten vorinkubiert. Der Testpuffer wurde auf 37 °C vorgewärmt und der Test wurde bei 30 °C im FDSS durchgeführt. Die maximalen [Ca2+]i-Reaktionen wurden als Verhältnis der Spitzenfluoreszenzintensität (Peakfluoreszenzintensität/Basalfluoreszenzintensität) gemessen und als Prozentsätze der Reaktion auf 4 μM Ionomycin ausgedrückt.

Alle in der Arbeit besprochenen Daten sind im Manuskript oder im SI-Anhang verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Madelyn Abraham für die Etablierung einer Methode zur Bewertung der Geruchsanpassung bei Teilnehmern, Mari Kobayashi für die Generierung der Plasmide von OPs und Mitgliedern des Edogawa-Krankenhauses für die Schleimsammlung.

Junkichi Yokoyama

Aktuelle Adresse: Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, Nadogaya Hospital, 2-1-1 Shinkashiwa, Kashiwa, Chiba, Japan

Sensory Science Research, Kao Corporation, 2606 Akabane, Ichikai-machi, Haga, Tochigi, Japan

Tomohiro Shirai, Dan Takase, Chisaki Uehara, Naoko Saito, Aya Kato-Namba und Keiichi Yoshikawa

Analytische wissenschaftliche Forschung, Kao Corporation, 1334 Minato, Wakayama, Wakayama, Japan

Kuniyuki Nakanishi

Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, Edogawa Hospital, 24.02.18 Higashikoiwa, Edogawa, Tokio, Japan

Junkichi Yokoyama

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TS, Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, formale Analyse, Untersuchung, Datenkuratierung, Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung sowie Projektverwaltung; DT, Methodik, Untersuchung und Schreiben – ursprüngliche Entwurfsvorbereitung; JY, Untersuchung und Überwachung; KN, Untersuchung; CU, Untersuchung; NS, Untersuchung und Überwachung; AK-N., Untersuchung; KY, Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, formale Analyse, Untersuchung, Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung.

Korrespondenz mit Keiichi Yoshikawa.

Die Autoren, mit Ausnahme von JY, sind Mitarbeiter der Kao Corporation. Kao Corporation besitzt ein Patent (P6588715) in Bezug auf menschliche Geruchsrezeptoren für p-Kresol und hat Patente in Bezug auf Methoden zur Verabreichung von Wasser an den Nasenschleim und zur Dampfstimulation von OPs angemeldet. Derzeit befinden sich keine zu deklarierenden Produkte in der Entwicklung oder auf dem Markt. Diese Arbeit wurde von der Kao Corporation unterstützt, die den Autoren Gehälter zur Verfügung stellte. Der Geldgeber hatte keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shirai, T., Takase, D., Yokoyama, J. et al. Funktionen des menschlichen Riechschleims und altersabhängige Veränderungen. Sci Rep 13, 971 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27937-1

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Eingegangen: 10. November 2022

Angenommen: 10. Januar 2023

Veröffentlicht: 18. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27937-1

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