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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 512 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die menschliche Darmmikrobiota produziert Dutzende kleiner Moleküle, die im Blut zirkulieren, sich in vergleichbaren Mengen wie Arzneimittel anreichern und die Physiologie des Wirts beeinflussen. Trotz der Bedeutung dieser Metaboliten für die menschliche Gesundheit und Krankheiten ist der Ursprung der meisten mikrobiell produzierten Moleküle und ihr Verbleib im Wirt weitgehend unbekannt. Hier entdecken wir einen kometabolischen Weg zwischen Wirt und Mikrobe zur Bildung von Hippursäure, einer der am häufigsten vorkommenden organischen Säuren im Urin von Säugetieren. Durch die Kombination stabiler Isotopenverfolgung mit Bakterien- und Wirtsgenetik zeigen wir die Reduktion von Phenylalanin zu Phenylpropionsäure durch Darmbakterien; Der Wirt oxidiert Phenylpropionsäure unter Beteiligung der mittelkettigen Acyl-CoA-Dehydrogenase (MCAD) erneut. Die Erzeugung keimfreier männlicher und weiblicher MCAD-/−-Mäuse ermöglichte eine gnotobiotische Kolonisierung in Kombination mit ungezielter Metabolomik, um zusätzliche mikrobielle Metaboliten zu identifizieren, die von MCAD im Wirtskreislauf verarbeitet werden. Unsere Ergebnisse decken einen Wirt-Mikroben-Weg für den reichlich vorhandenen, ungiftigen Phenylalanin-Metaboliten Hippurat auf und identifizieren die β-Oxidation über MCAD als einen neuartigen Mechanismus, durch den Säugetiere aus Mikrobiota stammende Metaboliten metabolisieren.

Das menschliche Darmmikrobiom produziert zahlreiche arzneimittelähnliche kleine Moleküle, die verschiedene Aspekte der menschlichen Biologie beeinflussen1,2,3,4. Diese Moleküle werden im Darm durch den Stoffwechsel von Molekülen aus der Nahrung und dem Wirt wie Glykanen, Proteinen und Aminosäuren produziert. Mikrobiota-abhängige Metaboliten beeinflussen die Physiologie lokal im Darm, wo ihre Konzentrationen am höchsten sind. Ein Teil davon wird jedoch über die Darmwand absorbiert und zirkuliert im ganzen Körper, wo sie die Wirtsphysiologie an Organen distal zum Darm beeinflussen kann5,6,7,8,9. Trotz umfangreicher neuerer Literatur, die die Auswirkungen mikrobieller Metaboliten auf den Wirt dokumentiert, bestehen erhebliche Wissenslücken über diese Moleküle. Dazu gehört vor allem die mangelnde Klarheit darüber, wie von Mikrobiota erzeugte Metaboliten mit dem Stoffwechsel des Wirts interagieren, sowie über die Identität und das Schicksal der Hauptprodukte. Solche Erkenntnisse sind wichtig, um zu verstehen, wie die Wirtsgenetik das Spektrum mikrobieller Metaboliten innerhalb eines Individuums beeinflusst, und um neue Biomarker für mikrobielle Funktionen im Darm zu identifizieren.

Darmmikrobielle Metaboliten gelangen in den Wirtskreislauf, wo sie durch Enzyme metabolisiert werden, die am Phase-I-Metabolismus (Modifikation durch Oxidation, Reduktion und Hydrolyse) und Phase-II-Metabolismus (Konjugation mit Glutathion, Sulfat, Glucuronsäure oder Aminosäuren – typischerweise Glycin oder Glutamin) beteiligt sind. klassischerweise für ihre Rolle im Arzneimittelstoffwechsel bekannt. Zu den Produkten des Phase-I- und Phase-II-Metabolismus mikrobieller Metaboliten gehören: (1) Indoxylsulfat10,11,12, ein Wirt-Mikroben-Co-Metabolit von Tryptophan, dessen Plasmaspiegel mit dem Versagen der Nieren ansteigen und der vermutlich zu den kardiovaskulären Folgen beiträgt bei Nierenerkrankungen im Endstadium13, 14; (2) p-Kresolsulfat, das sulfatierte Produkt des mikrobiellen Tyrosinabbaus, wird mit Herz-Kreislauf- und Nierenschäden in Verbindung gebracht9, 15; (3) Trimethylamin-N-oxid, ein Wirtsmikroben-Cometabolit trimethylhaltiger Verbindungen wie Cholin, dessen Plasmaspiegel mit unerwünschten Folgen bei Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen verbunden sind7. Viele aus dem Dickdarm stammende Metaboliten beim Menschen unterliegen Sulfatierungs- und Glukuronidierungsreaktionen16, aber das Ausmaß, in dem alternative Stoffwechselwege des Wirts zum großen Rest mikrobiell gewonnener Metaboliten beitragen, muss noch definiert werden.

Wir haben zuvor die Rolle des Phenyllactat-Dehydratase-Genclusters (FldABC, Abb. 1a) beim reduktiven Metabolismus aromatischer Aminosäuren durch Darmbakterien gezeigt, der für neun Metaboliten verantwortlich ist, die im Wirt zirkulieren17, einschließlich Indolpropionsäure (IPA) – einem mikrobiellen Metaboliten von Tryptophan, das die Darmpermeabilität moduliert 17, 18. Hier wollten wir verstehen, wie der Wirt zusätzliche vom fld-Locus erzeugte Verbindungen metabolisiert, die in den Kreislauf gelangen (ergänzende Abbildung 1). Mithilfe von Stoffwechselprofilen und der gnotobiotischen Besiedlung von Wildtyp-Mäusen (wt) stellen wir fest, dass der fld-Locus eine Schlüsseldeterminante für einen der am stärksten konzentrierten menschlichen Urinmetaboliten, Hippursäure, ist. Gnotobiotische Experimente mit transgenen Mäusen zeigen, dass Produkte des fld-Locus im Wirt über mittelkettige Acyl-CoA-Dehydrogenase (MCAD) einer β-Oxidation unterliegen. Unsere Ergebnisse decken einen bisher unbeachteten Mechanismus für den Co-Metabolismus von Wirt und Mikrobe auf, der zu den im Wirt zirkulierenden Metaboliten beiträgt.

a Schematischer Überblick über den Genort von C. sporogenes und den kodierten biochemischen Weg, der für den reduktiven Stoffwechsel aromatischer Aminosäuren verantwortlich ist. fldC, Phenyllactat-Dehydratase-Untereinheit C. b Keimfreie Swiss Webster-Mäuse wurden entweder mit Wildtyp-C. sporogenes oder seiner fldC-Mutante monokolonisiert. Körperflüssigkeiten wurden gesammelt und mittels GC-TOF-Shotgun-Metabolomik analysiert. c, e Metaboliten, die signifikant in WT-Mäusen (grün, positiver Fold-Change) oder fldC-kolonisierten Mäusen (rot, negativ) angereichert sind; Signifikante Metaboliten sind farbige, gepaarte zweiseitige t-Tests mit zweistufigem linearem Step-up-Verfahren von Benjamini, Krieger und Yekutieli, angepasster P-Wert < 0,05. d, f Metaboliten entsprechend (c, e), die sich deutlich zwischen WT- und fldC-kolonisierten Mäusen unterscheiden; Jede Spalte stellt die zeilennormalisierte Peakintensität für eine einzelne Maus dar. Metaboliten wurden in die Heatmap einbezogen, wenn sie in mindestens zwei untersuchten Wirtskompartimenten signifikant waren. Alle wichtigen Entdeckungen sind in den Zusatzdaten 2 aufgeführt. g fldC-abhängige Veränderungen der Metabolitenspiegel in den oxidativen und reduktiven Wegen für den Phenylalaninstoffwechsel im Darmlumen und möglicherweise damit verbundene Metaboliten im Wirtsurin. Das Mausschema in b wurde aus Lit. übernommen. 17.

Keimfreie Mäuse wurden entweder mit Wildtyp (WT) Clostridium sporogenes oder seiner Phenyllactat-Dehydratase-Mutante (fldC) monokolonisiert und Blinddarminhalt, Kot, Serum und Urin wurden für die metabolische Profilierung mittels Gaschromatographie-Flugzeitmasse gesammelt Spektrometrie (GC-TOF-MS) (Abb. 1b, Zusatzdaten 1, 2). In Übereinstimmung mit der Rolle des fldC-Gens im reduktiven Stoffwechsel aromatischer Aminosäuren stellten wir im Kot und im Blinddarminhalt von fldC-kolonisierten Mäusen (i) einen Verlust von Arylpropionat-Endprodukten und (ii) eine Anhäufung von Zwischenprodukten in der Nähe des Blocks fest im Stoffwechselweg (Aryllactate und Arylpyruvate) und (iii) ein Anstieg der Produkte des oxidativen Stoffwechselwegs (Arylacetate) (Abb. 1c, d). In ähnlicher Weise beobachteten wir im Serum und Urin von fldC-kolonisierten Mäusen verminderte Arylpropionatspiegel, erhöhte Aryllactate und einen Anstieg des wirtsmodifizierten Oxidationswegprodukts Phenylacetylglycin (Verbindung 4, ein Wirtsglycinkonjugat von Phenylacetat) (Abb. 1e). , F). Diese Ergebnisse bestätigen unsere früheren Erkenntnisse, dass ein einzelner mikrobieller Genort die Häufigkeit mehrerer aromatischer Aminosäuremetaboliten im Darmlumen und im Wirtskreislauf bestimmt17.

Interessanterweise identifizierte unsere Metabolomics-Analyse Hippursäure als einen der am höchsten angereicherten Metaboliten im Serum und Urin von WT-Mäusen im Vergleich zu fldC-kolonisierten Mäusen (Abb. 1e, f, Verbindung 11). Die Identifizierung von Hippursäure ist aus den folgenden drei Gründen bemerkenswert: (1) Hippursäure ist seit langem als eine der am häufigsten vorkommenden organischen Säuren im Urin von Säugetieren bekannt19, (2) die Darmmikrobiota trägt nachweislich zur Hippursäure bei Der Wirt4, 20, 21, es wurde jedoch gezeigt, dass kein Mikroorganismus oder Stoffwechselweg seine Spiegel beeinflusst (3), während Benzoat22 und Toluol23 in der Nahrung bekannte Vorläufer sind und andere Nahrungsverbindungen, einschließlich Phenylalanin24 und Polyphenole19, mit erhöhten Hippursäurespiegeln in Verbindung gebracht werden Der Beitrag des mikrobiellen Aminosäurestoffwechsels im Darm zur Hippursäure des Wirts wurde bisher nicht nachgewiesen. Darüber hinaus war die Häufigkeit des Endprodukts des oxidativen Phenylalanin-Metabolismus, des kardiotoxischen Moleküls Phenylacetylglycin8, im Urin von mit fldC kolonisierten Mäusen höher, was darauf hindeutet, dass der reduktive mikrobielle Metabolismus von Phenylalanin eine gesunde Alternative darstellen könnte. Angesichts der Tatsache, dass Phenylpropionsäure im Kot und im Blinddarminhalt von WT-kolonisierten Mäusen reichlich vorhanden war (Abb. 1c, d; Verbindung 3), jedoch in Serum und Urin nicht nachweisbar war, schlussfolgerten wir, dass mikrobiell produzierte Phenylpropionsäure dadurch in Hippursäure umgewandelt werden könnte der Wirt (Abb. 1g).

Um die Rolle des fldC-Genclusters bei der Hippursäureproduktion weiter zu untersuchen, validierten wir zunächst unsere GC-TOF-MS-Ergebnisse, indem wir Mäuse mit WT C. sporogenes oder der fldC-Mutante kolonisierten und die Hippursäurespiegel durch Flüssigchromatographie mit stabiler Isotopenverdünnung analysierten Spektrometrie (LC-MS). Diese Experimente ergaben, dass die Urin-Hippursäurespiegel bei fldC-kolonisierten Mäusen niedrig waren – ähnlich wie bei keimfreien Mäusen –, wohingegen WT-kolonisierte Mäuse millimolare Urin-Hippursäurespiegel aufwiesen (Abb. 2a). Als nächstes fragten wir, ob oral verabreichte Phenylpropionsäure als Vorstufe für Urin-Hippursäure dienen könnte. Wir verabreichten keimfreien Mäusen eine orale Sonde mit stabil isotopenmarkierter Phenylpropionsäure (d9-Phenylpropionsäure) und überwachten den Einbau der Markierung in Hippursäure (d5-Hippursäure) (Abb. 2b). Markierte Hippursäure war zum Zeitpunkt der d9-Phenylpropionsäure-Sondensonde (t = 0) nicht nachweisbar; Wir stellten jedoch einen Anstieg der markierten Hippursäure zum Zeitpunkt 3 und 6 Stunden fest, gefolgt von einem Abfall nach 9 Stunden, und die Werte waren 24 Stunden nach der Sondenernährung nicht mehr nachweisbar, was darauf hindeutet, dass Phenylpropionsäure vom Wirt in Hippursäure umgewandelt wird (Abb. 2c). Um die Hypothese, dass Hippursäure aus dem Phenylalaninstoffwechsel entsteht, an dem das fldC-Gen beteiligt ist, direkt zu testen, führten wir ein ähnliches Experiment zur Ermittlung stabiler Isotope an keimfreien und kolonisierten Mäusen durch, diesmal unter Verwendung von markiertem Phenylalanin (d5-Phenylalanin). Bei keimfreien Mäusen wurde keine markierte Hippursäure nachgewiesen (Abb. 2e), was darauf hindeutet, dass kein endogener Weg für die Hippursäureproduktion aus Phenylalanin existiert. Wir stellten jedoch hohe Konzentrationen an markierter Hippursäure im Urin von WT-kolonisierten Mäusen fest, wohingegen die Konzentrationen bei fldC-kolonisierten Mäusen nicht nachweisbar waren (Abb. 2e). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse einen neuen kometabolischen Weg zwischen Wirt und Mikrobe für die Umwandlung von Phenylalanin in der Nahrung in Hippursäure, der den fld-Locus erfordert.

a Urin wurde von keimfreien Mäusen (n = 10), fldC-kolonisierten Mäusen (n = 4) oder Wildtyp-C. sporogenes-kolonisierten Mäusen (n = 5) gesammelt und Hippursäure wurde unter Verwendung einer stabilen Isotopenverdünnungsmasse gemessen Spektrometrie (Einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichen, F(2, 16)=60,90). b Keimfreien Mäusen wurde eine Magensonde mit d9-Phenylpropionsäure verabreicht und der Einbau der Ringmarkierung in Hippursäure wurde quantifiziert, um zu bestimmen, ob Phenylpropionsäure eine Vorstufe von Hippursäure ist. c Die Verabreichung von d9-Phenylpropionsäure an keimfreie Mäuse führt zur Anreicherung von d5-Hippursäure im Urin (n = 12 Mäuse). d Keimfreien (n = 10 Mäusen), fldC-kolonisierten (n = 5) oder WT-kolonisierten (n = 5) Mäusen wurde isotopenmarkiertes Phenylalanin oral verabreicht, und markierte Hippursäure wurde im Urin über die Zeit überwacht. e Urin-d5-Hippursäure, gemessen 0, 3, 6, 9 oder 24 Stunden nach oraler Verabreichung von d5-Phenylalanin mittels stabiler Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie. Für a, c, e: Kästchen bezeichnen den Median mit Abstand zwischen den Quartilen; Whiskers, Maxima und Minima. In (c) wurde ein Ausreißer bei t = 3 h (55,88 µM d5-Hippursäure) mit der in GraphPad Prism 8 implementierten Extreme Studentized Deviate-Methode getestet und entfernt. Das Mausschema in b, d wurde aus Lit. angepasst. 17.

Nachdem wir einen Wirt-Mikroben-Kometabolismusweg für die Hippuratproduktion in monokolonisierten gnotobiotischen Mäusen identifiziert hatten, fragten wir als nächstes, ob diese Verbindungen in Mäusen vorhanden sind, die mit einer herkömmlichen Mikrobiota besiedelt sind. Um dieses Problem anzugehen, haben wir isogene Swiss Webster-Mäuse erhalten, die konventionell in drei verschiedenen Tierhaltungsbetrieben gezüchtet wurden (Jackson Labs, Taconic, Charles River, Abb. 3a). Anschließend haben wir Hippursäure und Phenylpropionsäure im Plasma und Urin dieser Mäuse mittels LC-MS quantifiziert. Interessanterweise stellten wir fest, dass nur bei Mäusen, die bei Jackson Labs (Jackson) gezüchtet wurden, Hippursäurespiegel im mikromolaren Bereich im Plasma vorhanden waren (Abb. 3b). In Übereinstimmung mit der Rolle von Phenylpropionsäure als Vorstufe für Hippursäure waren ihre Konzentrationen auch im Plasma konventionell gezüchteter Mäuse von Jackson Labs deutlich höher (Abb. 3c). Hippursäure war im Urin von Mäusen, die in den Jackson-Laboren aufgezogen wurden, ebenfalls erhöht (Abb. 3d). Um zu bestätigen, dass die Darmmikrobiota für die hohen Konzentrationen dieser Verbindungen verantwortlich ist, haben wir den Blinddarminhalt von Mäusen aus den Labors von Jackson und Charles Rivers erhalten und ihn auf keimfreie Swiss Webster-Mäuse transplantiert (Abb. 3e). Diese Experimente ergaben, dass nur der Blinddarminhalt von Mäusen, die in den Labors von Jackson gezüchtet wurden, den Phänotyp hoher Mengen an Hippursäure und Phenylpropionsäure im Plasma (Abb. 3f, g) und Hippurat im Urin (Abb. 3h) von keimfreien Ex-Mäusen aufwies Mäuse. Diese Ergebnisse unterstreichen zwei wichtige Erkenntnisse: Erstens, dass Hippursäure und ihre Vorstufe Phenylpropionsäure im Blut herkömmlicher Mäuse in mikromolaren Mengen zirkulieren. Zweitens gibt es erhebliche Unterschiede im Hippursäurespiegel bei Mäusen, die in verschiedenen Einrichtungen gezüchtet wurden, was darauf hindeutet, dass Variationen in der Mikrobiota zu Veränderungen im zirkulierenden Metabolom beitragen.

a Plasma- und Urinproben wurden von konventionellen Swiss Webster-Mäusen von Charles River, Jackson oder Taconic Laboratories gewonnen. Die Spiegel an Hippursäure (b) und Phenylpropionsäure (c) waren bei Mäusen aus Jackson-Labors im Vergleich zu Charles River oder Taconic signifikant höher. d Hippursäure war im Urin herkömmlicher Mäuse von Jackson Laboratories erhöht (normalisiert auf die Kreatininkonzentration). Für b–d: Einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Vergleichen, n = 5 Mäuse/Gruppe, Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Plasma-Hippursäure F(2,12) = 31,48, Plasma-PPA F(2,12) = 60,09, Urin-Hippursäure F(2,12) = 20,30. e Blinddarminhalte von herkömmlichen Swiss Webster-Mäusen, die von Charles River oder Jackson Laboratories bezogen wurden, wurden an keimfreie Empfänger transplantiert; Es wurden Plasma- und Urinproben entnommen. GF, keimfrei; CONV-D, konventionalisiert. Nach einer Blinddarmtransplantation waren die Plasma-Hippursäure (f) und Phenylpropionsäure (g) bei Empfängern aus Jackson Labs im Vergleich zu Charles River signifikant höher (ungepaarte zweiseitige t-Tests). h Hippursäure war im Urin von Mäusen mit Blinddarminhalt von Jackson-Labs-Mäusen signifikant höher (zweiseitiger Mann-Whitney-Test). Für f–h: n = 4 Mäuse/Gruppe, Mittelwert ± SEM dargestellt. Das Mausschema in a, e wurde aus Lit. übernommen. 17.

Nachdem wir den mikrobiellen Weg bestimmt hatten, der zur Bildung von Hippursäure beiträgt, wollten wir verstehen, wie der Wirt Hippursäure aus Phenylpropionsäure produziert. Das Oxidationswegprodukt von Phenylalanin (Phenylacetat) wird vom Wirt mit Glycin konjugiert, wodurch Phenylacetylglycin entsteht, wie bei fldC-kolonisierten Mäusen zu sehen ist (Abb. 1f). Es gelang uns jedoch nicht, das entsprechende Glycinkonjugat des Produkts des reduktiven Stoffwechselwegs von Phenylalanin, Phenylpropionylglycin, nachzuweisen. Wir stellten die Hypothese auf, dass Phenylpropionsäure vom Wirt durch β-Oxidation zu Benzoesäure verkürzt und dann mit Glycin konjugiert werden kann, um Hippursäure (auch als Benzoylglycin bekannt) zu bilden. Um diese Hypothese zu testen, haben wir mittelkettige Acyl-CoA-Dehydrogenase (MCAD)-Knockout-Mäuse (MCAD−/−)25 als keimfrei abgeleitet, um gnotobiotische Kolonisierungsexperimente zu ermöglichen. In Übereinstimmung mit früheren Studien an konventionell gezüchteten MCAD-/-Mäusen stellten wir einen charakteristischen biochemischen Defekt bei GF-MCAD-/-Mäusen fest, der durch höhere Serum-Acylcarnitin-Spiegel (C6, C8, C10:1 und C10) gekennzeichnet ist (ergänzende Abb. 2a) und von Suberinsäure und Hexanoylglycin im Urin (Ergänzende Abbildung 2b) nach einer 24-stündigen Fastenperiode.

Um zu testen, ob MCAD an der Hippursäureproduktion beteiligt ist, haben wir den Hippursäurespiegel im Urin von keimfreien und mit WT C. sporogenes kolonisierten MCAD-/−- und MCAD+/+-Mäusen untersucht. Diese Experimente ergaben, dass mit C. sporogenes kolonisierte MCAD-/-Mäuse im Vergleich zu MCAD+/+-Mäusen einen geringeren Hippursäurespiegel im Urin aufweisen (Abb. 4a). Darüber hinaus fanden wir heraus, dass MCAD-/-Mäuse Phenylpropionylglycin im Urin in Mengen anreichern, die zum Mangel der Hippursäurekonzentrationen komplementär sind (Abb. 4b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei MCAD-/−-Mäusen die β-Oxidation von Phenylpropionsäure teilweise blockiert ist, was einen zusätzlichen Weg zur Entsorgung mikrobieller Phenylpropionsäure als Phenylpropionylglycin auslöst (Abb. 4c). Zur Untermauerung unserer Daten haben frühere Studien eine Anhäufung von Phenylpropionylglycin im Urin von Menschen mit MCAD-Mangel gezeigt26. Obwohl die Art der restlichen Hippursäureproduktion in MCAD-/−-Mäusen unklar ist, spekulieren wir, dass es sich möglicherweise um peroxisomale Acyl-CoA-Oxidasen handelt27.

a, b Urin wurde von MCAD+/+- oder MCAD−/−-Mäusen entweder im keimfreien (GF) Zustand oder nach Besiedlung mit Wildtyp-C. sporogenes (Cs) gesammelt. Die Spiegel von Hippursäure (a) und Phenylpropionylglycin (b) wurden im Urin durch Massenspektrometrie mit stabiler Isotopenverdünnung bestimmt und auf den Kreatininspiegel im Urin normalisiert (n = 4 Mäuse/GF-Gruppe, n = 7 MCAD+/+ Cs-kolonisiert, n = 9). MCAD−/− Cs-kolonisiert; ungepaarte zweiseitige Student-t-Tests). c Modell für den Metabolismus von Phenylpropionsäure im Wirt unter Beteiligung von MCAD und Vorhandensein eines akzessorischen Stoffwechselwegs, der Phenylpropionsäure in Phenylpropionylglycin umwandelt. d Keimfreien Mäusen wurde isotopenmarkierte Phenylpropionsäure oral verabreicht und markiertes Phenylpropionylglycin wurde im Urin über die Zeit quantifiziert. e Urinspiegel von d9-Phenylpropionylglycin nach d9-Phenylpropionsäure-Schlundsonde bei GF MCAD−/−- oder MCAD+/+-Mäusen (n = 12 Mäuse/Gruppe), mittels stabiler Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie und normalisiert auf Urin-Kreatininspiegel. Für a, b, e: Kästchen bezeichnen den Median mit Interquartilabstand, Whisker-Maxima und -Minima. Das Mausschema in d wurde aus Lit. übernommen. 17.

Anhand der hier präsentierten Daten schlagen wir vor, dass Phenylalanin über einen Weg, der bakterielle Transformationen im Darm und im Wirtsstoffwechsel beinhaltet, in Hippursäure umgewandelt wird (ergänzende Abbildung 3). In Abwesenheit eines funktionsfähigen MCAD-Gens wird Phenylpropionsäure über einen akzessorischen Weg mit Glycin-N-Acyltransferase (GLYAT) weitergeleitet, wodurch Phenylpropionylglycin entsteht (Abb. 4c). In Übereinstimmung damit akkumulieren GF MCAD-/−-Mäuse, denen d9-Phenylpropionsäure verabreicht wurde (Abb. 4d), markiertes Phenylpropionylglycin, wohingegen GF-Mäuse mit funktionellem MCAD dies nicht tun (Abb. 4e) und leiten dieses Molekül stattdessen an Hippursäure weiter (Abb. 2c). ).

Nachdem wir die Rolle von MCAD beim Metabolismus von Phenylpropionsäure zu Hippursäure charakterisiert hatten, fragten wir als nächstes, ob zusätzliche mikrobielle Metaboliten durch MCAD metabolisiert werden. Um dieses Problem anzugehen, führten wir eine ungezielte Metabolomik an Urin von mit GF und C. sporogenes kolonisierten MCAD+/+- und MCAD−/−-Mäusen durch (Supplementary Data 3). Um uns auf mikrobielle Metaboliten zu konzentrieren, beschränkten wir unsere Untersuchung auf Verbindungen, die von der Besiedlung mit C. sporogenes abhängig waren (erhöhte Nachbesiedlung im Vergleich zu keimfrei). Anhand dieser Analysen identifizierten wir 29 LC-MS-Merkmale, die sich je nach Wirtsgenotyp unterschieden und im Urin von MCAD −/− Mäusen am stärksten ausgeprägt waren (Abb. 5a, ergänzende Abb. 4a). Durch die Durchsuchung unserer hauseigenen Metabolitendatenbank und öffentlich zugänglicher MS/MS-Datenbanken konnten wir mutmaßliche strukturelle Identifizierungen von vier Verbindungen ableiten, die wir anschließend durch Vergleich mit authentischen Standards verifizierten (Abb. 5b, Zusatzdaten 4). Wir waren beruhigt, als wir feststellten, dass Phenylpropionylglycin im Urin von MCAD-/−-Mäusen erhöht war, was mit der in Abb. 4 gezeigten Rolle von MCAD im Phenylpropionsäure-Hippursäure-Metabolismus übereinstimmt. Cinnamoylglycin, das Glycinkonjugat von Zimtsäure, war im Urin verringert von MCAD - / - Mäusen (ergänzende Abbildung 4a) und ist wahrscheinlich ein Zwischenprodukt im MCAD-abhängigen Metabolismus von Phenylpropionsäure (ergänzende Abbildung 3). Die Identifizierung zweier zusätzlicher Metaboliten, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure (4-OH-PPA) und Isocaproylglycin, war unerwartet. 4-OH-PPA ist das Reduktionsprodukt des Tyrosinstoffwechsels durch C. sporogenes, das auf demselben Weg wie der Phenylpropionsäurestoffwechsel erzeugt wird (ergänzende Abbildung 1), wohingegen Isocaproylglycin Ähnlichkeit mit dem C. sporogenes-Endprodukt des Leucinstoffwechsels, Isocapronsäure, aufweist5 .

a Von der Kolonisierung mit C. sporogenes abhängige Urinmetaboliten, die sich deutlich zwischen MCAD−/− (positive Faltveränderung, rot) und MCAD+/+ Mäusen (negativ, grau) unterscheiden. Metaboliten werden gefärbt, wenn sie signifikant sind (q-Wert < 0,05) und eine mehr als zweifache Änderung aufweisen (gepaarte t-Tests mit zweistufigem linearem Step-up-Verfahren von Benjamini, Krieger und Yekutieli). Benannte Metaboliten sind blau eingefärbt. b Gesamtionenchromatogramme und MS/MS-Fragmentierungsspektren zur Validierung von vier vorhergesagten Metaboliten in a. Die Standards sind oben aufgeführt. biologische Proben, unten in Blau. c Umwandlung von Tyrosin in 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure durch C. sporogenes und vorhergesagte Umwandlung in 4-Hydroxyhippursäure über Wirts-MCAD und Glycin-Konjugation, was 3-(4-Hydroxyphenyl)propionylglycin in MCAD–/– ergibt. d 4-OH-PPA und 4-OH-PPG reichern sich in Abwesenheit von MCAD an, wohingegen 4-OH-Hippursäure bei MCAD+/+-Mäusen höher ist (4-OH-PPA und 4-OH-Hippursäure: ungepaarte zwei- Tailed Student's t-Test, 4-OH-PPG: zweiseitiger Mann-Whitney). e C. sporogenes Metabolismus von Leucin produziert Isocapronsäure; vorhergesagte Produkte basierend auf der MCAD-Aktivität im Host. f Isocaproylglycin reichert sich in MCAD-defizienten Mäusen an, was darauf hindeutet, dass Isocapronsäure unter homöostatischen Bedingungen einer β-Oxidation des Wirts unterliegt (ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test). Für d und f: n = 14 Mäuse/GF-Gruppe, n = 11 MCAD+/+ Cs-kolonisierte, n = 12 MCAD−/− Cs-kolonisierte Mäuse; Die Daten wurden über zwei unabhängige Experimente hinweg kombiniert. Kästchen bezeichnen den Median mit Abstand zwischen den Quartilen, Whiskers zeigen Maxima und Minima an. g Vier zuvor nachgewiesene Verbindungen im Wirtskreislauf sind das Produkt des kanonischen Wirtsphase-I- (Flavinmonooxygenasen) und Phase-II-Metabolismus (Sulfatierung, Glutamin- oder Glycinkonjugation) mikrobiell produzierter Metaboliten. Die β-Oxidation (rot) des Wirts durch MCAD erzeugt Hippursäure und 4-Hydroxyhippursäure, zwei Verbindungen, die im Wirt häufig vorkommen.

In unserer ersten GC-TOF-Metabolomik identifizierten wir 4-Hydroxyhippursäure (4-OH-Hippursäure) im Urin als abhängig von fldC (ergänzende Abbildung 4b) und stellten zusammen mit der ungezielten MCAD-/−-Metabolomikanalyse die Hypothese auf, dass 4 -OH-PPA durchläuft eine ähnliche MCAD-abhängige Umwandlung wie Phenylpropionsäure (Abb. 5c). Wir verwendeten stabile Isotopenverdünnungs-LC-MS, um 4-OH-PPA, 4-OH-Hippursäure und 3-(4-Hydroxyphenyl)propionylglycin (4-OH-PPG, chemisch synthetisiert für diese Studie) im Urin von Keimen zu quantifizieren -freie und mit C. sporogenes kolonisierte MCAD−/−- und MCAD+/+-Mäuse. In Übereinstimmung mit der Rolle von MCAD in diesem Signalweg ist die 4-OH-Hippursäure im Urin bei MCAD+/+-Mäusen erhöht, wohingegen 4-OH-PPA bei MCAD−/−-Mäusen erhöht ist und 4-OH-PPG tendenziell einen signifikanten Anstieg aufweist in MCAD-/- Mäusen (Abb. 5d). Diese Ergebnisse stützen ein Modell, bei dem 4-OH-PPA auf ähnliche Weise wie Phenylpropionsäure über MCAD metabolisiert wird. Der MCAD-Weg verläuft nicht vollständig, da sowohl 4-OH-PPA (der Vorläufer) als auch 4-OH-PPG (das alternative Wegprodukt) im Urin kolonisierter MCAD+/+-Mäuse nachgewiesen werden (Abb. 5d). Diese Ergebnisse identifizieren mikrobiell produziertes 4-OH-PPA als zusätzliches Substrat für die β-Oxidation des Wirts über MCAD.

Wir haben vorhergesagt, dass mikrobielle Isocapronsäure auch durch MCAD des Wirts metabolisiert werden könnte (Abb. 5e). Da das kettenverkürzte und glycinkonjugierte MCAD-Produkt von Isocapronsäure, Isobutyrylglycin (Abb. 5e), zusammen mit Butyrylglycin eluiert, haben wir das Produkt quantifiziert, von dem wir annahmen, dass es sich in Abwesenheit von MCAD, Isocaproylglycin, ansammeln würde. In Übereinstimmung mit unseren Erwartungen waren die Isocaproylglycinspiegel bei MCAD −/− im Vergleich zu MCAD+/+ Mäusen durch LC-MS erhöht (Abb. 5f). Im Gegensatz zu Phenylpropionylglycin (Abb. 4b) und 4-OH-PPG (Abb. 5d) weisen keimfreie MCAD-/−-Mäuse nennenswerte Mengen an Isocaproylglycin auf, was darauf hindeutet, dass endogene Wirtswege diesen Metaboliten produzieren. Allerdings sind die Isocaproylglycin-Spiegel bei MCAD-/-Mäusen nach der Kolonisierung signifikant höher (P < 0,0001), was darauf hindeutet, dass die von C. sporogenes im Darm zugeführte Isocapronsäure die Isocaproylglycin-Spiegel bei MCAD-defizienten Mäusen erhöht (Abb. 5f). Diese Daten legen nahe, dass Isocapronsäure ein drittes Produkt des bakteriellen Stoffwechsels ist, das durch MCAD des Wirts metabolisiert wird.

Das Darmmikrobiom erweitert durch seinen Stoffwechsel von Verbindungen aus der Nahrung und dem Wirt den biochemischen Bestand des Wirts. Hier konzentrierten wir uns auf einen spezifischen mikrobiellen Stoffwechselweg, den durch den fld-Locus kodierten aromatischen Aminosäurestoffwechsel, und identifizierten einen kometabolischen Stoffwechselweg zwischen Wirt und Mikrobe, der zu einem der am häufigsten vorkommenden Urinmetaboliten bei Säugetieren, Hippursäure, beiträgt. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Phenylalanin im Darm in Phenylpropionat umgewandelt wird, das dann vom Wirt absorbiert und über MCAD einer β-Oxidation unterzogen wird, bevor es an Glycin konjugiert und im Urin ausgeschieden wird. Wir stellen auch fest, dass MCAD des Wirts am Metabolismus anderer mikrobiell gewonnener Substrate wie 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure (auch bekannt als Desaminotyrosin) und Isocapronsäure, einem Produkt des reduktiven Stoffwechselwegs des Leucinstoffwechsels, beteiligt ist. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass die β-Oxidation des Wirts durch MCAD ein bisher nicht identifizierter Mechanismus für den Wirtsstoffwechsel von aus Darmmikrobiota stammenden Molekülen ist (Abb. 5g).

Mehrere Wirtsenzyme, die auf Mikrobiota-abhängige Wirtsmetaboliten einwirken, sind gut charakterisiert. Dazu gehören Cytochrom P450, Flavinmonooxygenasen, Alkoholdehydrogenasen und Monoaminoxidasen, die reaktive oder polare Gruppen in Verbindungen einführen (Phase-I-Metabolismus), woraufhin aktivierte Metaboliten mit Glutathion-, Glycin-, Sulfat- und Glucuronsäurespezies konjugiert werden (Phase II). Während die Glycin-Konjugation typischerweise als Entgiftungsmechanismus angesehen wird, indem sie die Wasserlöslichkeit erhöht, um die Urinausscheidung zu erleichtern, wurde in jüngerer Zeit vermutet, dass die Glycin-Konjugation den systemischen Spiegel aromatischer Aminosäuren regulieren könnte, wie sie beispielsweise als Neurotransmitter verwendet werden28. Abgesehen vom Butyrat-Metabolismus wurde die β-Oxidation des Wirts jedoch nicht als wichtiger Mechanismus für den Metabolismus mikrobieller Metaboliten angesehen. Unsere Identifizierung von Phenylpropionsäure, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure und Isocapronsäure als wahrscheinliche Substrate für Wirts-MCAD steht im Einklang mit seiner bekannten Präferenz für Fettsäuren mit einer Länge von C6-C1229. Eine weitere Bestätigung unserer Ergebnisse sind der Nachweis der Aktivität von gereinigtem MCAD mit Phenylpropionyl-CoA als Substrat26 und Studien an Patienten mit MCAD-Mangel, bei denen erhöhte Phenylpropionylglycinspiegel im Urin, verringerte Hippursäure26, 30 und erhöhte Isocaproylglycinwerte31 festgestellt wurden. Obwohl vermutet wurde, dass die Stoffwechselaktivität im Darm für die Produktion dieser Metaboliten verantwortlich ist32, 33, liefern unsere Ergebnisse mit gnotobiotischen Mäusen und der Bakteriengenetik nun endgültige Beweise. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass MCAD Teil der wachsenden Liste von Wirtsenzymen ist, die über den Co-Metabolismus mit Darmbakterien reichlich zirkulierende Metaboliten erzeugen.

Ein interessantes Thema, das sich aus unserer Analyse des Co-Metabolismus zwischen Wirt und Mikrobe ergibt, ist, dass mehrere mikrobielle Metaboliten als ihre Glycinkonjugate ausgeschieden werden. Dies ist vermutlich auf die Aktivität der Glycin-N-Acyltransferase (GLYAT) des Wirts zurückzuführen, einem mitochondrialen Enzym, das Acyl-CoAs und Glycin als Co-Substrate verwendet und so Acylglycine und CoASH bildet. Die metabolische Begründung für die Glycin-Konjugation bei Säugetieren ist nicht ganz klar, es wurden jedoch mehrere Hypothesen aufgestellt (zusammengefasst in Lit. 28): (1) Die Glycin-Konjugation verändert die Lipophilie aromatischer Metaboliten wie Benzoesäure und begrenzt so deren Toxizität. (2) Die Glycinkonjugation über GLYAT recycelt CoASH, das für eine Reihe von entscheidenden biochemischen Aktivitäten erforderlich ist. (3) Reduzierte Glycinspiegel im Wirt aufgrund der Konjugation mit überschüssigen aromatischen Metaboliten könnten einen molekularen Kreislauf darstellen, der die Ernährungspräferenz beeinflusst.

Es wurde postuliert, dass Hippursäure im menschlichen Urin mikrobiell stammt4, 16, 20, 34,35,36, es wurde jedoch weder ein Mikroorganismus noch ein mikrobielles Gen definiert, das für seine Produktion verantwortlich ist. Unsere Ergebnisse bei gnotobiotischen Mäusen, die mit Wildtyp- oder fldC-Mutanten C. sporogenes kolonisiert wurden, legen nahe, dass der reduktive Metabolismus von Phenylalanin eine Hauptquelle für Hippursäure im Wirt ist. Frühere Studien deuten jedoch darauf hin, dass Hippursäure durch mikrobiotaunabhängige Mechanismen (z. B. Einnahme von Benzoesäure oder Toluol-Exposition) oder durch mikrobiellen Abbau von Polyphenolen und Flavonoiden aus der Nahrung, wie sie beispielsweise in Kaffee und Tee enthalten sind, entsteht19. Tatsächlich hat umfangreiche Literatur die Ausscheidung von Hippursäure beim Menschen mit dem Verzehr von Tees, Säften und Früchten in Verbindung gebracht, von denen bekannt ist, dass sie reich an Polyphenolen sind (Übersicht in Lit. 19). Daher scheint es wahrscheinlich, dass das Ausmaß der Hippursäureausscheidung bei Einzelpersonen multifaktoriell ist und nicht-mikrobielle Beiträge über die Nahrung sowie Beiträge aus dem mikrobiellen Metabolismus von Phenylalanin (wie wir gezeigt haben) und Nahrungspolyphenolen darstellen. Um die relativen Beiträge dieser Nahrungs- und Mikrobenquellen zur Hippursäureproduktion herauszufinden, wird wahrscheinlich eine stabile Isotopenverfolgung mit markierten Lebensmittelbestandteilen erforderlich sein. In diesem Sinne zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, in der Mäuse mit isotopenmarkierten Nahrungsbestandteilen gefüttert wurden, dass Nahrungsprotein mit einem geschätzten Anteil von 33 % ein wichtiger Vorläufer für systemische Hippursäure ist37.

Über die Identifizierung von MCAD als Wirtsenzym hinaus, das für die Metabolisierung mikrobieller Metaboliten verantwortlich ist, hat unsere Arbeit mehrere weitere wichtige Implikationen: Erstens ist Hippursäure allgegenwärtig und wurde nicht mit gesundheitsschädlichen Folgen beim Menschen in Verbindung gebracht, Phenylacetylglycin (Phenylacetylglutamin beim Menschen), das Glycin- konjugiertes Produkt des oxidativen Phenylalaninstoffwechsels, ist mit einem erhöhten Risiko für Herzerkrankungen verbunden8. Daher stellt die reduktive Umwandlung von Phenylalanin über Phenylpropionsäure zu Hippursäure, die für den Menschen weitgehend als ungiftig gilt, eine vergleichsweise gesunde Alternative zum oxidativen Weg zur Phenylacetatproduktion dar. Zweitens könnte ein mikrobieller Weg, der bei hohem Fluss funktioniert und Phenylalanin in ein ungiftiges Endprodukt umwandelt, für Patienten mit Phenylketonurie, bei denen der Phenylalaninspiegel im Blut erhöht ist, von erheblichem Interesse sein. In diesem Sinne haben frühere Gruppen gezeigt, dass Escherichia coli, die so manipuliert wurden, dass sie Phenylalanin im Darm abbauen, den Blutspiegel senken kann. Die Identifizierung natürlich vorkommender Darmbakterien, die Phenylalanin im Darm abbauen können, stellt eine Alternative zu manipulierten Stämmen dar.

Diese Arbeit präsentiert einen allgegenwärtigen Stoffwechselweg bei Säugetieren als einen neuen Weg, über den der Wirt mehrere von der Darmmikrobiota erzeugte Verbindungen metabolisiert. Zusätzlich zu Phenylpropionsäure, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure und Isocapronsäure reichern sich mehrere nicht identifizierte glycinkonjugierte Produkte des bakteriellen Stoffwechsels in Abwesenheit von funktionellem MCAD an, was darauf hindeutet, dass diese Moleküle unter homöostatischen Bedingungen zuvor einer β-Oxidation unterliegen zur Glycin-Konjugation. Wirts-MCAD stellt somit einen breiten und bisher nicht vermuteten Mechanismus für den Metabolismus mikrobieller Metaboliten dar.

Alle Tierversuche wurden nach einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der Stanford University genehmigt wurde. Alle Mausexperimente wurden in einer speziellen gnotobiotischen Anlage unter Verwendung von aseptischen Brutisolatoren mit flexibler Folie oder experimentellen Isolatoren, beide von Class Biologically Clean (Madison, WI), durchgeführt. In einigen kürzeren Experimenten (<1 Woche) wurde ein IsoCage P-Racksystem mit HEPA-Filtration auf Käfigebene (Tecniplast, Buguggiate, Italien) verwendet. Die Tiere wurden in einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten und mit Standardfutter (LabDiet 5K67) und Wasser nach Belieben gefüttert. Die Sterilität der Tiere wurde durch zweiwöchentliche anaerobe und aerobe Zellkulturen von Kot für repräsentative Tiere aus jedem Isolator und PCR des 16S-rRNA-Locus verifiziert. Erste ungezielte Metabolomics-Mausexperimente wurden an gnotobiotischen keimfreien Swiss Webster-Mäusen (männlich, 8–12 Wochen alt, n = 5 pro Gruppe) durchgeführt, die ursprünglich von Taconic Biosciences bezogen wurden. Zusätzliche Experimente wurden an MCAD-/-Mäusen (B6;129P2-Acadmtm1Uab/Mmmh)25 durchgeführt, die ursprünglich als Embryonen vom Mutant Mouse Resource & Research Center (MMRRC, Kat.-Nr. 011588-MU) erhalten und an das National Gnotobiotic übertragen wurden Rodent Resources Center (NGRRC), wo sie durch Embryotransfer in keimfreie C57/BL6-Mäuse wiedergewonnen wurden. Heterozygote keimfreie MCAD+/−-Mäuse wurden in unsere Einrichtung für gnotobiotische Mäuse in Stanford überführt, wo die Kolonie erweitert wurde und die Zucht als homozygote MCAD−/−- oder MCAD+/+-Hintergrundbrutpaare mit isogenem Hintergrund aufrechterhalten wurde, wobei letztere als Kontrollen dienten. Konventionelle Swiss Webster-Mäuse wurden von Taconic, Jackson Laboratories und Charles River Laboratories bezogen. Die Mäuse wurden mit Standardfutter gefüttert und in flexiblen Folienisolatoren gehalten. Jedes Experiment zum Vergleich des Besiedlungszustands und/oder des Wirtsgenotyps wurde mit geschlechtsgleichen Tieren durchgeführt. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet; Das Geschlecht der in einem bestimmten Experiment verwendeten Tiere wurde durch die Tierverfügbarkeit in unserer gnotobiotischen Einrichtung bestimmt.

Clostridium sporogenes ATCC 15579 wurde routinemäßig in verstärkten Clostridienmedien (RCM, 10 g/L Pepton, 10 g/L Rindfleischextrakt, 3 g/L Hefeextrakt, 5 g/L Dextrose, 5 g/L Natriumchlorid, 1 g/L) kultiviert. L lösliche Stärke, 0,5 g/L Cysteinhydrochlorid, 3 g/L Natriumacetat, 0,5 g/L Agar) bei 37 °C in einer anaeroben Kammer von Coy Laboratories unter einer Atmosphäre aus 5 % Wasserstoff, 10 % CO2 und 85 % N2 . Die fldC-Mutante von C. sporogenes, die eine ClosTron-Insertionsmutation enthält, wurde zuvor erzeugt17 und unter identischen Bedingungen wie der Wildtyp-Stamm kultiviert. Bakterienzellen wurden bei –80 °C als anaerob hergestellte 25 % v/v Glycerinvorräte gelagert, die in 12 × 32 mm großen Glasfläschchen mit Bördelverschluss versiegelt waren. Flüssigkulturen wurden vor der Sondenernährung in sterile 2-ml-Kryoröhrchen mit Innengewinde überführt. Alle Manipulationen mit C. sporogenes wurden in der anaeroben Kammer und mit vorreduzierten Reagenzien und Medien für mindestens 48 Stunden durchgeführt.

Der Maus-MCAD-Genotyp wurde mit DNA-PCR bestätigt, die auf das Neomycin-Insert abzielte, das zwischen MCAD+/+ und MCAD+/− oder MCAD−/− unterscheidet, sowie mit RT-PCR zum Nachweis des MCAD-Transkripts. Das Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit (Kat.-Nr. 69506) wurde verwendet, um DNA aus Ohrstanzen zu extrahieren. Die verwendeten Primer waren: NeoF 5′-CATTCGACCACCCAAGCGAAACATC-3′, NeoR 5′-ATATCACGGGTAGCCAACGCTATG-3′25. Das Produkt wurde auf einem 3 %igen Agarosegel mit einer erwarteten Bandengröße von 289 bp für den heterozygoten und Knockout-Genotyp analysiert und kein Produkt für den Wildtyp-Genotyp. Die RNA wurde mit dem Qiagen RNeasy Mini-Kit (Kat.-Nr. 74104) aus dem Schwanzclip extrahiert und die RT-PCR mit dem Qiagen One Step RT-PCR-Kit (Kat.-Nr. 210212) durchgeführt. Die verwendeten Primer waren: M11588F 5'- ATGTGGCGGCCATTAAGACCAAAG-3', M11588R 5'- GCTGATTGGCAATGTCTCCAGCAA-3'. Die Produkte wurden auf einem 3 %igen Agarosegel abgebildet; Sowohl MCAD+/+- als auch MCAD+/−-Tiere haben ein einzelnes 550-bp-Produkt, während MCAD-/−-Tiere einen Leitereffekt mit ungefähren Produktgrößen von 700, 800, 1000 bp und mehr haben.

Keimfreie Swiss Webster-Mäuse (männlich, 8–12 Wochen alt, n = 5 pro Gruppe) wurden entweder mit Wildtyp Clostridium sporogenes ATCC 15579 oder seinem fldC-Mutantenstamm17 (1 × 107 KBE pro Maus, 200 µL) kolonisiert. Vier Wochen nach der Kolonisierung wurden Urin und Kot gesammelt, dann wurden die Mäuse eingeschläfert und Blut wurde durch Herzpunktion gesammelt und der Blinddarminhalt wurde entnommen. Serum wurde aus Vollblut unter Verwendung von BD-Mikrotainern (Kat.-Nr. 365967) gemäß den Richtlinien des Herstellers gewonnen, dann in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert. Urin, Kot und Blinddarminhalt wurden in 2-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss überführt und unmittelbar nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei –80 °C gelagert. Die Proben wurden auf Trockeneis zum West Coast Metabolomics Center der University of California, Davis, geschickt, wo Metaboliten extrahiert, derivatisiert und mittels Gaschromatographie-Flugzeit-Massenspektrometrie (GC-TOF-MS) analysiert wurden.

Proben (Serum 30 µL, Kot und Blinddarminhalt ~20 mg und Urin 20 µL) wurden bei 4 °C aufgetaut, dann wurden Metaboliten extrahiert, derivatisiert und durch GC-MS unter Verwendung von Standardprotokollen analysiert, wie zuvor beschrieben38. Die gemeldeten Daten (Ergänzungsdaten 1) stellen Peakhöhen für jedes entsprechende Quantifizierungsion dar, normiert auf die Summe der Peakhöhen für alle genannten Metaboliten innerhalb einer Behandlungsgruppe.

Metaboliten, die in der Shotgun-Metabolomics-Plattform identifiziert wurden, wurden in die nachgelagerte Analyse einbezogen. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde die Entdeckung mithilfe des zweistufigen linearen Step-up-Verfahrens von Benjamini, Krieger und Yekutieli mit Q = 5 %, implementiert in GraphPad Prism v.8.4.1, bestimmt. Die Peakflächen wurden log10-normalisiert und jeder Metabolit wurde einzeln analysiert, ohne eine konsistente SD mit insgesamt 225 t-Tests für jedes Wirtskompartiment anzunehmen.

Für Experimente zur Bestimmung stabiler Phenylpropionsäureisotope wurden keimfreien Mäusen 200 µl einer steril filtrierten 50 mM Lösung von d9-Phenylpropionsäure (C/D/N-Isotope, Kat. Nr. D-5666), gelöst in Wasser, durch orale Sondenernährung verabreicht eine 1-ml-Tuberkulinspritze, ausgestattet mit einer 18–19-Gauge-Nadel (Popper 7900). Der Urin wurde zum Zeitpunkt t = 0, 3, 6, 9, 24 Stunden nach der Sondenernährung gesammelt und d5-Hippursäure im Urin durch LC-MS quantifiziert (Einzelheiten siehe Abschnitt zur LC-MS-Methode).

Für Phenylalanin-Stabilisotopenverfolgungsexperimente wurden Mäusen 200 µL einer steril filtrierten 50 mM Lösung von d5-Phenylalanin (Sigma Kat.-Nr. 615870), gelöst in Wasser, durch orale Sondenernährung mit einer 1-ml-Tuberkulinspritze mit 18–19 Gauge verabreicht Sondennadel (Popper 7900). Der Urin wurde zum Zeitpunkt t = 0, 3, 6, 9, 24 Stunden nach der Sondenernährung gesammelt und d5-Hippursäure im Urin durch LC-MS quantifiziert (Einzelheiten siehe Abschnitt zur LC-MS-Methode). Die Bestimmung stabiler Isotope wurde erstmals an keimfreien Mäusen durchgeführt, um die endogene Umwandlung von markiertem Phenylalanin zu testen. Anschließend wurden dieselben Mäuse entweder mit Wildtyp- oder fldC-mutiertem Clostridium sporogenes durch orale Sondenernährung (200 µL, ~1 × 107 KBE) kolonisiert und eine Woche nach der Kolonisierung wurde eine stabile Isotopenverfolgung durchgeführt.

Für die Zwecke dieser Studie wurden MCAD-/-Mäuse als keimfrei reproduziert. MCAD-/-Mäuse oder MCAD+/+-Kontrollen wurden in sterilen gnotobiotischen Isolatoren oder Käfigen mit HEPA-gefilterter Luftzufuhr gehalten. Die Bestimmung stabiler Isotope wurde wie oben beschrieben durchgeführt: Urin von GF MCAD–/–- und MCAD+/+-Mäusen wurde unter sterilen Bedingungen unmittelbar vor der Sondenernährung mit 50 mM d9-Phenylpropionsäure und 3, 6, 9 und 24 Stunden danach gesammelt. Sieben Tage später wurden Mäuse mit Wildtyp-C. sporogenes durch Sondenernährung mit 200 µl gesättigter Übernachtkultur monokolonisiert. Eine Woche nach der Kolonisierung wurden die D9-Phenylpropionsäure-Schlundsonde und die Urinsammlung nach 0, 3, 6, 9 und 24 Stunden wiederholt. Die Kolonisierung mit C. sporogenes wurde durch serielle Verdünnungsplattierung verifiziert. Kreatinin, Hippursäure, markiertes und unmarkiertes Phenylpropionylglycin im Urin wurden durch LC-MS quantifiziert (Einzelheiten finden Sie im Abschnitt zur LC-MS-Methode).

Im Verlauf dieser Studie haben unsere Labore von der primären Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometers (Agilent 6470) auf ein Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer (Q-TOF) (Agilent 6545XT) umgestellt, also auf Methoden zur LC-MS-Quantifizierung von Die Metaboliten unterschieden sich geringfügig, wie unten beschrieben. Lösungsmittel in LC-MS-Qualität wurden von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) bezogen; d3-Kreatinin, von Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, MA). Es wurde kein Versuch unternommen, die natürliche Häufigkeit schwerer Isotope zu korrigieren, da die deuterierten Verbindungen, die wir für die Verabreichung an Mäuse und als interne Standards ausgewählt haben, so unterschiedlich waren, dass die interessierenden Analyten vernachlässigbar beeinträchtigt würden (z. B. enthält die Isotopenreinheit von d2-Hippursäure < 0,1 % Hippursäure und D5-Hippursäure).

Zur Bestätigung des Hippursäurespiegels im Urin von keimfreien, WT- und fldC-kolonisierten Mäusen (Abb. 2a) und zur stabilen Isotopenverfolgung von d9-Phenylpropionsäure und d5-Phenylalanin bei Swiss Webster-Mäusen (Abb. 2c, e) verwendeten wir stabile Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie mit einem Agilent 6470 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer. Unmarkierte Hippursäure wurde von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) gekauft. Zur Probenvorbereitung wurden 5 µL Urin mit 45 µL Wasser in LC-MS-Qualität verdünnt, dann wurden 50 µL 6 % v/v Sulfosalicylsäure in Wasser zugegeben, um Proteine auszufällen. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 12.000 × g wurden 50 µL des Überstands in ein neues Röhrchen überführt und 75 µL 50 % Acetonitril mit 2,5 µM d5-Hippursäure (Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, MA) als interner Standard hinzugefügt. Für Experimente, bei denen d5-Hippursäure im Urin von Mäusen nachgewiesen werden sollte (z. B. zur Bestimmung stabiler Isotope), wurde 2,2-d2-Hippursäure (C/D/N-Isotope, Pointe-Claire, Quebec, Kanada) verwendet ein interner Standard, der seinem entsprechenden SRM-Übergang folgt (180.1→136.1). Die Röhrchen wurden zum Mischen kurz geschüttelt, dann zentrifugiert und auf eine 96-Well-Autosampler-Platte mit einer Silikonkappenkarte überführt und vor der Analyse bei 4 °C gelagert. Die Verbindungen wurden mit einem Agilent 1290 Infinity II UPLC, ausgestattet mit einer Agilent RRHD 1,8 µm Partikelgröße C18-Säule (2,1 × 50 mm), getrennt und mit einem Agilent 6470 Triple Quad Massenspektrometer, ausgestattet mit einer Jet-Stream-Elektrospray-Ionisationsquelle, nachgewiesen. Eluent A bestand aus 0,1 % Ameisensäure (v/v) in Wasser und Eluent B bestand aus 0,1 % Ameisensäure (v/v) in Acetonitril. Proben (5 μl) wurden über einen gekühlten Autosampler in die mobile Phase injiziert und eine chromatographische Trennung bei 40 °C wurde mit einer Flussrate von 0,5 ml/min unter Verwendung des folgenden Gradienten erreicht: 0–1,5 min, 10–12 % B; 1,5–1,75 Min., 12–90 % B; 1,75–2,75 Min., 90 % B; 2,75–3 Min., 90–10 % B; 3–4,75 Min., 10 % B. Die ersten 0,5 Min. wurden in den Abfall umgeleitet, dann wurden Hippursäureisotope im negativen Ionisationsmodus unter Verwendung der spezifischen SRM-Übergänge für Hippursäure (178,1→134,0) und des internen Standards d5-Hippursäure ( 183,1→139,1) mit einer Verweilzeit von 200 ms, einer Fragmentorspannung von 100 V und einer Kollisionsenergie von 9 V. Die Peakflächen wurden mit dem internen Standard normalisiert und die Konzentrationen wurden durch Vergleich mit Kalibrierungskurven bestimmt, die aus Verdünnungsreihen des authentischen Standards erstellt wurden (Hippursäure, Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Zu den Elektrospray-Ionisationsparametern gehörten eine Gastemperatur von 300 °C, ein Gasfluss von 6 l/min, eine Hüllgastemperatur von 350 °C, ein Hüllgasfluss von 12 l/min und eine Kapillarspannung von 2500 V.

Zur Quantifizierung von Hippursäure und N-(3-Phenylpropionyl)glycin (PPG) in MCAD+/+ und MCAD−/− gnotobiotischem Mausurin (Abb. 3) verwendeten wir eine stabile Isotopenverdünnung mit einem Agilent 6545XT Q-TOF. Wir haben auch das Kreatinin im Urin quantifiziert, um die gelösten Urinwerte bei allen Tieren zu normalisieren. Mäuseurinproben (5 μl) wurden mit internen Standards (10 μl, d3-Kreatinin und 2,2-d2-Hippursäure, jeweils 0,5 mM) gemischt und mit Wasser in LC-MS-Qualität (15 μl) in 96-Well-V verdünnt -Bodenplatten von USA Scientific. 90 μl einer Acetonitril/Methanol-3:1-Mischung wurden hinzugefügt, um Proteine auszufällen. Die Lösung wurde fünfmal durch Pipettieren gemischt, dann wurde die Platte 10 Minuten lang bei 4 ° C und 5000 × g zentrifugiert. Der Überstand (40 μl) wurde auf 96-Well-Autosampler-Platten mit 160 μl Wasser überführt, gut gemischt und eine Abdeckmatte auf die Platten gelegt. Die Proben wurden mittels LC-MS mit einem Agilent 1290 Infinity II UPLC, ausgestattet mit einer Waters BEH C18-Säule mit 1,7 μm Partikelgröße (2,1 × 100 mm), analysiert und mit einem Agilent 6545XT Q-TOF, ausgestattet mit einer Dual-Jet-Stream-Elektrospray-Ionisationsquelle, detektiert Betrieb im erweiterten Dynamikbereich (EDR 1700 m/z). Eluent A bestand aus 0,1 % Essigsäure (v/v) in Wasser und Eluent B bestand aus 0,1 % Essigsäure (v/v) in Acetonitril. Proben (0,5 μl) wurden über einen gekühlten Autosampler in die mobile Phase injiziert und eine chromatographische Trennung bei 40 °C wurde mit einer Flussrate von 0,4 ml/min unter Verwendung des folgenden Gradienten erreicht: 0–2 Minuten, 1 % B; 2–6 Minuten, 1–98 % B; 6–7 Minuten, 98 % B; 7–7,5 Min., 98–1 % B; 7,5–11 Minuten, 1 % B. Die Quantifizierung von Kreatinin wurde im ESI-Positivmodus unter Verwendung von d3-Kreatinin als internem Standard durchgeführt. Die Quantifizierung von d5-Hippursäure und d5-N-(3-Phenylpropionyl)glycin wurde im ESI-Negativmodus unter Verwendung von 2,2-d2-Hippursäure als internem Standard durchgeführt. Zu den Elektrospray-Ionisationsparametern gehörten eine Fragmentorspannung von 140 V, eine Gastemperatur von 300 °C, eine Hüllgastemperatur von 275 °C und eine Kapillarspannung von 4000 V. Die Peakflächen wurden unter Verwendung des internen Standards (d2-Hippursäure für Hippursäure und Phenylpropionylglycin) normalisiert , d3-Kreatinin für Kreatinin) und die Konzentrationen wurden durch Vergleich mit Kalibrierungskurven bestimmt, die aus Verdünnungsreihen authentischer Standards (Kreatinin, Hippursäure und Phenylpropionylglycin, Toronto Research Chemicals, North York, Ontario, Kanada) erstellt wurden, versetzt mit 1× PBS-Lösung als Ersatzmatrix. Der Kalibrierungsbereich für Kreatinin betrug 0,029–30 mM und für Hippursäure und Phenylpropionylglycin 0,020–20 mM. Auf Kreatinin und Hippursäure wurde ein lineares Kalibrierungsregressionsmodell angewendet; Auf Phenylpropionylglycin wurde ein quadratisches Regressionsmodell unter Verwendung eines 1/x-gewichteten Regressionsalgorithmus der kleinsten Quadrate angewendet. R2 = 0,996 für Kreatinin und 1,000 für Hippursäure und Phenylpropionylglycin.

Für D9-Phenylpropionsäure-Stabilisotopenverfolgungsexperimente wurde d9-N-(3-Phenylpropionyl)glycin quantifiziert. Urinproben wurden gemäß dem obigen Protokoll vorbereitet und analysiert, mit der Ausnahme, dass der Überstand (20 μl) in Autosamplerplatten mit 96 Vertiefungen mit 180 μl Wasser verdünnt wurde. Quantifizierung organischer Säuren im Urin und verwandter Metaboliten. Zur Quantifizierung von Adipinsäure, Korksäure und Hexanoylglycin wurden Mausurinproben (2,5 μl) mit internen Standards (15 μl, d3-Kreatinin und d2-Isovaleriansäure, jeweils 0,2 mM) gemischt und mit Wasser in LC-MS-Qualität verdünnt ( 7,5 μL) in 96-Well-Platten mit V-Boden von USA Scientific. Zur Ausfällung der Proteine wurde eine Acetonitril/Methanol-3:1-Mischung (75 μl) zugegeben. Die Lösung wurde fünfmal durch Pipettieren gemischt, dann wurde die Platte 5 Minuten lang bei 15.000 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand (10 μl) wurde auf 96-Well-Autosampler-Platten mit 90 μl Wasser überführt, gut gemischt und eine Abdeckmatte auf die Platten gelegt. Die Proben wurden mittels LC-MS mit einem Agilent 1290 Infinity II UPLC, ausgestattet mit einer Waters BEH C18-Säule mit 1,7 μm Partikelgröße (2,1 × 100 mm), analysiert und mit einem Agilent 6545XT Q-TOF, ausgestattet mit einer Dual-Jet-Stream-Elektrospray-Ionisationsquelle, detektiert Betrieb im erweiterten Dynamikbereich (EDR 1700 m/z). Eluent A bestand aus 0,1 % Essigsäure (v/v) in Wasser und Eluent B bestand aus 0,1 % Essigsäure (v/v) in Methanol. Proben (2 μl) wurden über einen gekühlten Autosampler in die mobile Phase injiziert und eine chromatographische Trennung bei 60 °C wurde mit einer Flussrate von 0,4 ml/min unter Verwendung des folgenden Gradienten erreicht: 0–1 min, 1 % B; 1–15,5 Min., 1–45 % B; 15,5–15,6 Minuten, 45–99 % B; 15,6–16,9 Minuten, 99 % B, 16,9–17 Minuten, 99–1 % B; 17–19 Minuten, 1 % B. Die Quantifizierung von Kreatinin wurde im ESI-positiven Modus unter Verwendung von d3-Kreatinin als internem Standard durchgeführt. Die Quantifizierung von Adipinsäure, Suberinsäure und Hexanoylglycin wurde im ESI-Negativmodus unter Verwendung von d2-Isovaleriansäure als internem Standard durchgeführt. Zu den Elektrospray-Ionisationsparametern gehörten eine Fragmentorspannung von 70 V, eine Gastemperatur von 250 °C, eine Hüllgastemperatur von 250 °C und eine Kapillarspannung von 4000 V. Die Peakflächen wurden unter Verwendung des internen Standards normalisiert und die Konzentrationen wurden durch Vergleich mit erstellten Kalibrierungskurven bestimmt aus Verdünnungsreihen authentischer Standards. Der Kalibrierungsbereich beträgt 0,005–40 mM für Kreatinin, 0,010–10 mM für Adipinsäure, 0,020–10 mM für Suberinsäure und 0,005–20 mM für Hexanoylglycin. Das lineare Kalibrierungsregressionsmodell wurde auf Adipinsäure und Suberinsäure angewendet, und das quadratische Regressionsmodell wurde auf Kreatinin und Hexanoylglycin angewendet, wobei der 1/x-Regressionsalgorithmus der kleinsten Quadrate verwendet wurde. R2 = 0,996, 0,998, 0,999 und 1,000 für Adipinsäure, Suberinsäure, Hexanoylglycin und Kreatinin.

Der Blinddarminhalt wurde von Swiss Webster-Mäusen verschiedener Anbieter (Taconic, Jackson Laboratories, Charles River Laboratories) entnommen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert. Der Blinddarminhalt von n = 5 Mäusen wurde auf Eis aufgetaut, gepoolt und oral in keimfreie Swiss Webster-Empfängermäuse verabreicht. Anschließend wurden die Mäuse zwei Wochen lang in einem Isocage P-Käfigständersystem mit Standardfutter gefüttert, bis Urin- und Plasmaproben für die LC-MS-Analyse gesammelt wurden.

Metaboliten wurden aus Plasma- und Urinproben extrahiert, mit 3-Nitrophenylhydrazin derivatisiert und wie zuvor beschrieben mittels LC-MS analysiert39.

Eine ungezielte Metabolomik wurde an Urinproben von Mäusen durchgeführt, die vor der Verabreichung von d5-Phenylalanin oder d9-Phenylpropionsäure (t = 0 h) entnommen wurden. Mausurinproben (2,5 μl) wurden mit Wasser in LC-MS-Qualität (5 μl) verdünnt und mit internem Standard (7,5 μl, d3-Kreatinin, 1 mM; d9-Phenylpropionsäure, 0,2 mM; 2,2-d2-Hippursäure) gemischt Säure, 0,2 mM), dann 60 μl Extraktionslösungsmittel mit Referenzstandards (d7-Glucose, d3-Methionin, L-4-Hydroxyphenyl-d4-alanin, d5-Hippursäure, d5-Tryptophan, d3-Leucin, di-n -Octylphthalat-3,4,5,6-d4, D19-Decansäure, D15-Octansäure, D27-Tetradecansäure, 2-Flurophenylglycin, D9-Carnitin in Methanol) wurde zugegeben, um Proteine auszufällen. Die Lösung wurde verwirbelt, dann wurde die Platte 5 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 × g zentrifugiert. Der Überstand (60 μl) wurde auf eine neue Platte übertragen und jeweils 20 μl mit 60 μl Wasser in LC-MS-Qualität verdünnt. Der Rest des Überstands wurde als Backup bei –80 °C gelagert. Drei Leerproben wurden mit der gleichen Vorbereitungsmethode mit LC-MS-Wasser (2,5 μl) anstelle der Urinprobe einbezogen. Qualitätskontrollen (QC) wurden von jeder LC-MS-fähigen Probe gepoolt.

Proben (0,5 μl) wurden einer LC-MS/MS-Analyse sowohl im ESI-Positivmodus als auch im Negativmodus unterzogen. Die Methode im Negativmodus war dieselbe wie im obigen Absatz beschrieben. Bei der Positivmodusmethode wurden die gleichen Gradienten- und Elektrospray-Ionisationsparameter angewendet, wobei Eluent A aus 0,1 % Ameisensäure (v/v) in Wasser und Eluent B aus 0,1 % Ameisensäure (v/v) in Methanol bestand. Die Erfassung erfolgte im All-Ions-Fragmentierungsmodus mit Kollisionsenergien von 0, 20 und 40 eV. Die Merkmalsidentifizierung wurde mit MS-DIAL (Version 4.24) durchgeführt, indem entweder (a) unsere eigene authentische Standardbibliothek40 durchsucht wurde oder (b) mit MSMS-Spektren verglichen wurde, die in der Mass Databank of North America (MoNA) verfügbar sind. Enthaltene Suchparameter: Massengenauigkeit: MS1-Toleranz: 0,005 Da, MS2-Toleranz: 0,025 Da. Minimale Peakhöhe der Peakerkennung: 2000 Amplitude, Massenschichtbreite: 0,05 Da. Dekonvolutionsparameter: Sigma-Fensterwert: 0,5, MS/MS-Häufigkeitsgrenze: 5 Amplitude. Identifizierung MSP-Datei: LC-MS/MS-Spektren aus der MoNA-Datenbank heruntergeladen, genaue Massentoleranz (MS1): 0,01 Da, genaue Massentoleranz (MS2): 0,05 Da. Retentionszeit und genaue massenbasierte Bibliothek: Stanford-Verbindungsbibliothek, Retentionszeittoleranz: 0,1 min, genaue Massentoleranz: 0,01 Da. Ausrichtungsparameter: Referenzdatei: QC01, Retentionszeittoleranz: 0,1 min, MS1-Toleranz: 0,015 Da. Peaks sowohl im positiven als auch im negativen Modus wurden mit der Höhe von 2,2-d2-Hippursäure normalisiert und zur Entfernung entarteter Merkmale nach MS-CleanR41 exportiert. Als Filter wurden ein Mindestrohwertverhältnis von 0,8, eine falsche Masse und ein relativer Massendefekt von 50–3000 angewendet. Zur Berechnung der Cluster wurde eine Pearson-Korrelation ≥ 0,8 verwendet und die intensivsten Peaks wurden in jedem Cluster beibehalten. Mit Retentionszeit/genauer Massenbibliothek versehene Verbindungen wurden für die gezielte Sammlung von MS/MS-Spektren ausgewählt und mit Referenzstandards zur Bestätigung der Identität verglichen (alle Daten in den Zusatzdaten 3).

Dieselben Proben, an denen ungezielte Metabolomics durchgeführt wurden, wurden weiter auf interessierende Metaboliten analysiert, die bei ungezielten Analysen identifiziert wurden (Supplementary Data 4). Die Quantifizierung von Phenylpropionsäure, N-Cinnamoylglycin, Phenylpropionylglycin, 4-Hydroxyhippursäure, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure, N-(3-(4-Hydroxyphenyl)propionyl)glycin und Isocaproylglycin wurde mit demselben Instrument und derselben Säule durchgeführt im ESI-Negativmodus. Eluent A bestand aus 0,1 % Essigsäure (v/v) in Wasser und Eluent B bestand aus 0,1 % Essigsäure (v/v) in Methanol. Proben (0,5 μl) wurden über einen gekühlten Autosampler in die mobile Phase injiziert und eine chromatographische Trennung bei 50 °C wurde mit einer Flussrate von 0,3 ml/min unter Verwendung des folgenden Gradienten erreicht: 0–1 min, 1 % B, 1–9 min , 1–99 % B, 9–11 Min., 99 % B, 11–11,5 Min., 99–1 % B, 11,5–16 Min., 1 % B. Zu den Elektrospray-Ionisationsparametern gehörten eine Fragmentorspannung von 70 V und eine Gastemperatur von 250 °C, eine Hüllgastemperatur von 250 °C und eine Kapillarspannung von 4000 V. Die Peakflächen wurden unter Verwendung des internen Standards normalisiert und die Konzentrationen wurden durch Vergleich mit Kalibrierungskurven bestimmt, die aus Verdünnungsreihen authentischer Standards erstellt wurden. Der Kalibrierungsbereich für Phenylpropionsäure betrug 0,020–30 mM, 0,003–12 mM für Phenylpropionylglycin, 0,020–30 mM für 4-Hydroxyhippursäure, 0,049–30 mM für 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure und 0,020–12 mM für N -(3-(4-Hydroxyphenyl)propionyl)glycin, 0,003–12 mM für Isocaproylglycin und 0,12–30 mM für N-Cinnamoylglycin. Das lineare Kalibrierungsregressionsmodell wurde auf N-(3-(4-Hydroxyphenyl)propionyl)glycin und Kreatinin angewendet, und das quadratische Regressionsmodell wurde auf die anderen Verbindungen unter Verwendung des 1/x-gewichteten Regressionsalgorithmus der kleinsten Quadrate angewendet. R2 = 0,999, 0,999, 0,999, 0,998, 0,998, 1,000 und 0,990 für Kreatinin, Isocaproylglycin, 4-Hydroxyhippursäure, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure, N-(3-(4-Hydroxyphenyl)propionyl)glycin, Phenylpropionylglycin und N-Cinnamoylglycin.

Acylcarnitin-Profile wurden mithilfe eines klinisch validierten Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrietests mit einem SCIEX 4500-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer bewertet. Der vollständige Satz unbeschrifteter (Kat.-Nr.: NSK-B-US-1, NSK-B-G1-US-1, ULM-7195-PK) und gekennzeichnetem (Kat.-Nr.: NSK-B, NSK-B-G1). , DLM-9067-0.1MG) Acylcarnitin-Standards wurden von Cambridge Isotopes (Tewksbury, MA) bezogen. Zur Probenvorbereitung wurden 20 μl Plasma mit 300 μl Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure, das den vollständigen Satz interner Isotopenstandards enthielt, präzipitiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 13.000 × g wurden die Überstände in ein neues Röhrchen überführt und mit Stickstoff eingedampft. Anschließend wurden die Proben 15 Minuten lang mit 100 μl 3 N Salzsäure in Butanol bei 65 °C derivatisiert. Nach der Derivatisierung wurden die Proben mit Stickstoff eingedampft. Anschließend wurden die getrockneten Proben mit 80 % Acetonitril in Wasser rekonstituiert und in 96-Well-Autosampler-Fläschchen mit Silikonkappe überführt. Der gekühlte Autosampler wurde auf 4 °C eingestellt. Proben (4 μl) wurden unmittelbar nach der Probenvorbereitung injiziert. Extrakte wurden durch Fließinjektionsanalyse in das Massenspektrometer eingebracht. Die Bedingungen der isokratischen mobilen Phase waren 100 % Acetonitril mit einer Flussrate von 0,1 ml/min. Acylcarnitin-Spezies wurden im ESI mit positiver Polarität mithilfe eines Vorläuferionenscans von 85 m/z über den Massenbereich von 200–550 m/z nachgewiesen. Die Elektrospray-Ionisationsparameter betrugen 5500 V für die Ionenspray-Spannung, 200 °C für die Quellentemperatur und ein Druck von 20 PSI für die Gase 1 und 2. Zur Quantifizierung wurden die Peakhöhen mit dem internen Standard normalisiert und die Konzentrationen durch Vergleich mit der Kalibrierung bestimmt Kurven, die für jedes Acylcarnitin erstellt wurden.

MS-DIAL wurde zum Peak-Calling und zur Integration von MCAD+/+ vs. MCAD−/− LC-MS-Daten zur ungezielten Metabolomik verwendet. Alle anderen Analysen und Visualisierungen wurden mit Excel und GraphPad Prism (Versionen 8 und 9, graphpad.com) durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten ungezielten Massenspektrometriedaten wurden in der Metabolomics Workbench-Datenbank hinterlegt. Rohdaten zur GC-TOF-Shotgun-Metabolomik sind unter der Zugangsnummer ST001606 verfügbar; ungezielte LC-MS-Daten, ST001633. Unsere Analysen dieser Datensätze finden Sie in den Zusatzdaten 1–4; Alle übrigen in dieser Studie generierten Daten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Lalla Fall für die technische Unterstützung bei der LC-MS-Analyse, Shuo Han für die Unterstützung bei der Zusammenstellung authentischer Standards, Tim Meyer für die Bereitstellung urämischer gelöster Stoffe und dem ChEM-H Metabolomics Knowledge Center der Stanford University für die Unterstützung bei der Entwicklung der LC-MS-Methode und Zugang zu Instrumenten. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Ford Foundation Predoctoral Fellowship und ein National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) an KMP finanziert, National Institutes of Health gewährt DK110335 (DD), GM142873 (DD), AT011396 (DD), DK101674 (JLS). , DK085025 (JLS). JLS und MAF sind Chan Zuckerberg Biohub Investigators.

Curt R. Fischer

Derzeitige Adresse: Octant Bio, Emeryville, CA, USA

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Kali M. Pruss, William Van Treuren, Steven K. Higginbottom, Michael A. Fischbach, Justin L. Sonnenburg und Dylan Dodd

Abteilung für Pathologie Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Haoqing Chen, Yuanyuan Liu, John B. Jarman, Tina M. Cowan und Dylan Dodd

ChEM-H, Stanford University, Stanford, CA, USA

Curt R. Fischer & Michael A. Fischbach

Stanford Healthcare, Palo Alto, Kalifornien, USA

Justin Mak & Beverly Wong

Abteilung für Bioingenieurwesen, Stanford University, Stanford, CA, USA

Michael A. Fischbach

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, USA

Michael A. Fischbach & Justin L. Sonnenburg

Zentrum für menschliche Mikrobiomstudien, Stanford, CA, USA

Justin L. Sonnenburg

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Statement DD, JLS, MAF und TMC haben diese Studie konzipiert und gestaltet. KMP, DD, WVT, JBJ, YL und SH führten Mausexperimente durch und halfen bei der Probenvorbereitung. HC, DD, JM, BW und CF haben LC-MS-Assays entworfen und durchgeführt. Alle Autoren lieferten geistige Beiträge. KMP, HC, DD, JLS und MAF haben den Artikel geschrieben und alle Autoren haben Feedback gegeben.

Korrespondenz mit Dylan Dodd.

DD und MAF sind Mitbegründer von Federation Bio. Alle übrigen Autoren geben keine konkurrierenden Interessen an.

Nature Communications dankt Andre Marette und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Pruss, KM, Chen, H., Liu, Y. et al. Der Co-Metabolismus von Wirt und Mikrobe über MCAD erzeugt zirkulierende Metaboliten, einschließlich Hippursäure. Nat Commun 14, 512 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36138-3

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Eingegangen: 30. Oktober 2022

Angenommen: 17. Januar 2023

Veröffentlicht: 31. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36138-3

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