Primäre Zilien steuern die zelluläre Strukturierung der Meibom-Drüsen während der Morphogenese, nicht jedoch die Lipidzusammensetzung

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 282 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Meibomdrüsen (MGs) sind modifizierte Talgdrüsen, die die Lipide des Tränenfilms produzieren. Trotz ihrer entscheidenden Rolle bei der Aufrechterhaltung einer klaren Sicht bleiben die Mechanismen, die der MG-Morphogenese bei Entwicklung und Krankheit zugrunde liegen, unklar. Zilienvermittelte Signale sind entscheidend für die Entwicklung von Hautanhangsgebilden, einschließlich Talgdrüsen. Daher untersuchten wir die Rolle von Zilien bei der MG-Morphogenese während der Entwicklung. Die meisten Zellen waren während der frühen MG-Entwicklung mit Flimmerhärchen versehen, gefolgt von der Zerlegung der Zilien während der Differenzierung. In reifen Drüsen waren Flimmerzellen hauptsächlich auf die Basalschicht des proximalen Drüsen-Zentralgangs beschränkt. Die Ablation der Zilien in Keratin14-exprimierendem Gewebe störte die Ansammlung proliferativer Zellen an der distalen Spitze, hatte jedoch keinen Einfluss auf die Gesamtproliferations- oder Apoptoserate. Darüber hinaus führte eine beeinträchtigte Zellstrukturierung während der Elongation zu einer Hypertrophie reifer MGs mit erhöhtem Meibumvolumen, ohne die Lipidzusammensetzung zu verändern. Somit bieten Zilien-Signalnetzwerke eine neue Plattform für die Entwicklung therapeutischer Behandlungen für MG-Dysfunktion.

Meibomdrüsen (MGs) sind holokrine Drüsen, die sich in den Fußwurzelplatten der oberen und unteren Augenlider befinden. Diese modifizierten Talgdrüsen (SGs) bestehen aus Ansammlungen sekretorischer Acini, die ihr Sekret in mehrere kürzere Gänge abgeben, die vom zentralen Gang der Drüse abzweigen. Das Sekretionsprodukt Meibum (bestehend aus Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren der gesamten Zelle) wird schließlich am Augenlidrand freigesetzt. Anschließend breitet sich das Meibum als äußerste Schicht des Tränenfilms bei jedem Lidschlag auf der Augenoberfläche aus1,2. Diese lipidreiche Schicht spielt eine entscheidende Schutzfunktion für die Augenoberfläche, da sie beim Blinzeln als Gleitmittel für die Augenlider fungiert, das Überlaufen von Tränen auf die Lider verhindert und die Tränenverdunstung reduziert1,3.

Defekte MGs führen zu einer Meibomdrüsen-Dysfunktion (MGD), definiert als „eine chronische, diffuse Anomalie der MGs, die üblicherweise durch eine Obstruktion des Endgangs und/oder qualitative/quantitative Veränderungen in der Drüsensekretion gekennzeichnet ist“4. Eine verringerte Lipidsekretion kann zur Instabilität des Tränenfilms beitragen und den Eintritt in den Teufelskreis des Trockenen Auges (DED) erleichtern, einer der am häufigsten auftretenden Augenerkrankungen mit einer weltweiten Prävalenz von 5 bis 50 %5. Das Trockene Auge wird in zwei Hauptkategorien unterteilt, die sich nicht gegenseitig ausschließen: Trockenes Auge mit Flüssigkeitsdefizit (ADDE) und Verdunstungstrockenes Auge (EDE)6. MGD gilt als Hauptursache für EDE und KCS6,7,8. Die jüngste Entwicklung therapeutischer Lösungen zur Behandlung von MGD umfasst Augenschmiermittel, Augenliderwärmungsgeräte und intensiv gepulstes Licht, wobei der Schwerpunkt hauptsächlich auf der Linderung von MG-Obstruktionen oder dem Ersatz von Lipiden liegt9. Es besteht jedoch ein ungedeckter Bedarf an Behandlungen zur Vorbeugung von MG-Atrophie und zur Stimulierung der Lipidproduktion. Dieser Mangel an derzeit wirksamen pharmakologischen Zielen ist in erster Linie auf das sehr begrenzte Wissen über molekulare Netzwerke zurückzuführen, die der Entwicklung und Erneuerung von MG zugrunde liegen und das Ziel für eine effiziente und dauerhafte Behandlung von MGD sein könnten.

Die Bildung von MG beim Menschen erfolgt während der Embryonalentwicklung zwischen dem dritten und siebten Schwangerschaftsmonat, entsprechend der Phase des geschlossenen Augenlids1. Bei Mäusen beginnt die MG-Entwicklung am Embryonaltag 18,5 (E18,5) und setzt sich postnatal fort10. Wie beim Menschen findet die MG-Entwicklung bei Mäusen während der Phase des geschlossenen Augenlids statt, die für die MG-Entwicklung unabdingbar ist11,12.

Obwohl vermutet wurde, dass die MG-Entwicklung Ähnlichkeiten mit der Entwicklung der Talgdrüseneinheit aufweist, die einen Haarfollikel und die damit verbundenen SGs umfasst, sind die grundlegenden Mechanismen, die der MG-Entwicklung und -Erneuerung zugrunde liegen, noch wenig verstanden. Wie Haarfollikel entwickeln sich MGs aus der ektodermalen Schicht, die sich in das Mesoderm einstülpt und eine Anlage bildet. Dann entwickelt die Meibom-Anlage, ähnlich wie die Haaranlage der Wimpern, seitliche Auswüchse, die sich später in Ductuli und Talgdrüsenacini differenzieren13. In der murinen Entwicklung bildet sich bei E18.5 eine epitheliale Plakode, gefolgt von einer Einstülpung in das Mesenchym und einer Verlängerung der Plakode, einer Verzweigung der MGs ab etwa dem 5. postnatalen Tag (P5) und dem Erwerb ihrer reifen Morphologie durch P1510.

Primäre Zilien sind auf Mikrotubuli basierende Zellorganellen, die aus dem Basalkörper stammen und sich von der Plasmamembran erstrecken. Der intraflagellare Transport (IFT), eine bidirektionale Bewegung von Proteinpartikeln entlang des Axonems, gewährleistet den ordnungsgemäßen Aufbau und die Aufrechterhaltung der Zilien14,15,16,17,18. Eine Funktionsstörung des primären Ciliums führt zu einer heterogenen Gruppe von Krankheiten, die als Ziliopathien bezeichnet werden und von denen einige schwerwiegende Entwicklungsstörungen hervorrufen, was die entscheidende Rolle des primären Ciliums bei der Gewebeentwicklung unterstreicht19. Das primäre Cilium spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung von aus dem Ektoderm abgeleiteten Geweben, einschließlich der Haut, dem Hornhautepithel und der Talgdrüseneinheit20,21. Insbesondere moduliert das primäre Cilium die Verdickung des Hornhautepithels durch die Regulierung der Zellproliferation und der vertikalen Migration22. In der Haut begrenzen primäre Zilien die Hyperproliferation von Keratinozyten in der Epidermis23,24. Darüber hinaus führt die primäre Zilienablation zum Stillstand der Haarfollikelmorphogenese24,25,26,27,28,29,30 und zu einer Fehlregulation des Haarwachstumszyklus31. Patienten mit dem Bardet-Biedl-Syndrom, einer autosomal-rezessiv vererbten Ciliopathie, leiden an mehreren Hauterkrankungen, darunter Keratosis pilaris und seborrhoische Dermatitis32. Interessanterweise induziert die primäre Zilienablation eine Hyperplasie der SG-Läppchen, was auf eine zilienabhängige regulatorische Rolle bei der SG-Entwicklung hinweist23. Die Pathogenese dieser Zilien-assoziierten Hauterkrankungen und die Mechanismen, die der abnormalen Vergrößerung der SGs zugrunde liegen, sind jedoch weiterhin unbekannt. Obwohl die Rolle des primären Ziliums in verschiedenen aus Ektoderm gewonnenen Geweben untersucht wurde, ist seine Rolle bei der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Funktion von MG weiterhin unbekannt.

In dieser Studie zeigen wir, dass MG-Zellen in den frühen Entwicklungsstadien Flimmerhärchen tragen und Meibozyten bei der Differenzierung ihr primäres Zilium verlieren. Wir zeigen, dass das primäre Cilium für die Regulierung des zentralen Gangdurchmessers und der Gesamtgröße von MGs erforderlich ist. Wir schlagen einen Mechanismus vor, durch den primäre Zilien die frühe MG-Zellmusterung bestimmen, indem sie die räumliche Verteilung proliferierender und sterbender Zellen innerhalb der sich entwickelnden Drüsen steuern. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Zilien-vermittelte Signalwege potenzielle therapeutische Ziele zur Bekämpfung von MGD darstellen.

Um die Beteiligung primärer Zilien an der MG-Morphogenese zu bestimmen, haben wir den bedingten Knockout K14-Cre;Ift88fl/fl (hier als cKO bezeichnet) generiert. Bei dieser Maus wird das Ift88-Gen, das für eine Untereinheit der IFT-Maschinerie kodiert, die für den Aufbau und die Aufrechterhaltung der Zilien33 erforderlich ist, in allen Epithelzellen, die Keratin 14 (K14) exprimieren, einschließlich MG-Geweben, herausgeschnitten. Die Expression der K14-Cre-Rekombinase wurde unter Verwendung der mT/mG-Reportermauslinie34 verfolgt (Ergänzung Abb. 1). In der transgenen Linie K14-Cre;Ift88floxed;mT/mG führte die Cre-abhängige Entfernung einer Kassette, die das rot fluoreszierende membranspezifische tdTomato (mT) exprimierte, zur Expression eines membranspezifischen grün fluoreszierenden Proteins (mG) in K14 -exprimierende Gewebe (Ergänzung Abb. 1). Um die primäre Zilienablation bei MGs zu überwachen, haben wir ARL13B, ein Protein, das mit der Ziliarmembran assoziiert ist, immunnachweist35,36. Bei P3 waren Zilien auf praktisch allen MG-Zellen der Kontrollmäuse vorhanden. Im Gegensatz dazu fehlten Zilien oder waren in MG-Zellen von cKO-Mäusen sehr kurz (Ergänzung Abb. 1). Wie bereits beschrieben, ähnelte das äußere Erscheinungsbild neugeborener cKO-Mäuse im Allgemeinen dem der Kontrollmäuse22,23. Da Defekte bei der Fusion und Öffnung der Augenlider während der Entwicklung die MG-Morphogenese beeinflussen können, haben wir diese Prozesse im Detail analysiert11. Die Fusion und Öffnung der Augenlider erfolgte sowohl bei cKO- als auch bei Kontrollmäusen um E15,5 bzw. P13, was die Ergebnisse früherer Studien bestätigt22,23. Wir bemerkten jedoch das Vorhandensein multifokaler, weißer, körniger bis kalkiger seborrhoischer Ablagerungen entlang der Augenlidränder der meisten erwachsenen cKO-Mäuse, was bei Kontrollmäusen nicht beobachtet wurde (Abb. 1a).

a Repräsentative Bilder von Kontroll- und cKO-Augen von Erwachsenen (6 Monate). Der Pfeil zeigt eine weiße Ablagerung an, die nur bei cKO-Mäusen beobachtet wird. b Repräsentative Bilder von mit ORO gefärbten Fußwurzelplatten bei P6 und P8. Eingerahmte Bereiche geben die Bereiche an, die bei höherer Vergrößerung angezeigt werden. Maßstabsbalken, 200 µm; N, nasal; T, zeitlich. c Die Anzahl der MGs und die MG-Größe wurden bei P6 und P8 quantifiziert (n = 20 Kontrollen und 5 cKO-Mäuse bei P6; n = 13 Kontrollen und 9 cKO-Mäuse bei P8). Pro Maus wurde die MG-Fläche durch Mittelung der MG-Fläche aller einzelnen MGs im oberen und unteren Augenlid bestimmt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests bewertet. ns, nicht signifikant, P ≥ 0,05. d Repräsentative Bilder von mit ORO gefärbten Fußwurzelplatten bei P21. Eingerahmte Bereiche geben die Bereiche an, die bei höherer Vergrößerung angezeigt werden. Maßstabsbalken, 200 µm; N, nasal; T, zeitlich. e Repräsentative Bilder von Kontroll- und cKO-MGs, gefärbt mit HE bei P6 und P21. Eingerahmte Bereiche geben die Bereiche an, die bei höherer Vergrößerung angezeigt werden. Maßstabsbalken, 200 µm.

Die Ölrot-O-Färbung (ORO) der Fußwurzelplatte ergab, dass die Anzahl der MGs pro Augenlid (oberes und unteres) bei Kontroll- und cKO-Mäusen bei P6 und P8 ähnlich war (Abb. 1b, c). Allerdings waren die gefärbten Bereiche der cKO-MGs bei P6 bzw. P8 29 % bzw. 21 % größer als die der Kontrollmäuse (Abb. 1c). Reife MGs, wie sie bei Mäusen bei P21 beobachtet wurden, schienen sowohl bei cKO-Mäusen als auch bei Kontrollmäusen sehr nahe beieinander zu sein, was die genaue Umrisse einzelner Drüsen und damit die Messung ihrer Oberfläche erschwerte (Abb. 1d). Allerdings schienen MGs in den Fußwurzelplatten der cKO dichter verteilt zu sein als in denen der Kontrollmäuse. Ungefärbte Herde waren zwischen der proximalen Region benachbarter MGs in der Kontrolle sichtbar, jedoch nicht im cKO (Pfeile in Abb. 1d). Darüber hinaus wurden keine signifikanten Unterschiede in den MG-Abmessungen zwischen Männern und Frauen desselben Genotyps beobachtet (Ergänzung Abb. 2), und beide Geschlechter wurden für die gesamte Studie zusammengefasst. Trotz der Unterschiede in der MG-Größe ergab die histologische Analyse, dass die Morphologie der basalen und differenzierenden Meibozyten sowohl bei der Mutante als auch bei der Kontrolle ähnlich war und bei mutierten Mäusen keine Anzeichen einer Gangverstopfung beobachtet wurden (Abb. 1e).

Angesichts der signifikanten Expansion der mutierten MGs fragten wir, ob die Lipidproduktion und -zusammensetzung in der Zilienmutante verändert war. Die Lipidprofile der Fußwurzelplattenextrakte wurden mittels hochauflösender Massenspektrometrie (MS) in Kombination mit isokratischer und Gradienten-Umkehrphasen-Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie bewertet. Es wurden etwa 150 Analyten mit einzigartigen Kombinationen von Retentionszeiten und Masse-zu-Ladungs-Verhältnissen (m/z) identifiziert. Repräsentative Massenspektren einer Kontroll-Wildtyp-Probe sind in Abb. 2a – c dargestellt. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) ergab keine offensichtliche Häufung der Kontroll- oder cKO-Proben (Abb. 2d), was darauf hindeutet, dass ihre chemischen Zusammensetzungen ähnlich waren. Die Analyse von Proben für einen Satz von 15 Hauptlipidspezies aus den Familien Wachsester (WE) und Cholesterylester (CE) zeigte jedoch einen ungefähr zweifachen Anstieg der Menge produzierter Lipide in der cKO-Mutante im Vergleich zu Kontrollmäusen ( Abb. 2e). Insgesamt führte die primäre Zilienablation in den MGs zu einer Vergrößerung der MGs und einer Verdoppelung der Lipidproduktion, ohne den gesamten Reifungsprozess der Meibozyten und damit die Lipidzusammensetzung des Meibums zu beeinträchtigen.

a Ein analytisches Signal von freiem Cholesterin (Chl) und Cholesterinester (CEs) von einer Kontrollmaus. b Ein Beobachtungsspektrum des Pools an Meibomwachsestern (WEs) einer Kontrollmaus. (c) Ein Beobachtungsspektrum der Pools von Triacylglycerinen (TAGs), α,ω-diacylierten Diolen (DiADs) und Cholesterylestern von (O)-acylierten ω-Hydroxyfettsäuren (Chl-OAHFAs) einer Kontrollmaus. d Ein mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) für die Kontrolle (C, gelbe Punkte) und cKO (M, grüne Punkte) erstelltes Ergebnisdiagramm. LC/MS-Daten zeigten eine starke Überlappung der Kontroll- und Mutantenproben von Meibom-Lipiden ohne klare Clusterbildung der Proben unterschiedlicher Art unter Angabe ihrer nahen biochemischen Zusammensetzung. e Allerdings führte die primäre Ziliumablation zu einer insgesamt höheren Lipidproduktion in den Tarsalplatten von cKO-Mäusen im Vergleich zum Lipidgehalt von Kontrollmäusen (n = 6 für Ctrl und n = 6 für cKO). Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests bewertet.

Um Einblicke in die Rolle der Zilien bei der MG-Größenkontrolle zu gewinnen, versuchten wir, die räumlich-zeitliche Verteilung der primären Zilien in den sich entwickelnden und reifen MGs der transgenen Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP-Maus zu bestimmen (Abb. 3). Diese Maus exprimiert ARL13B, ein Zilienmembran-assoziiertes Protein, fusioniert mit dem monomeren rot fluoreszierenden Protein mCherry, und Centrin2, ein zentriolares Protein, fusioniert mit GFP, was zu rot und grün fluoreszierend markierten Zilien bzw. Basalkörperchen führt35,36,37 ,38. Da die Größe und Morphologie der MGs je nach ihrer Position innerhalb der Fußwurzelplatte variiert (Abb. 1b), haben wir die MGs beginnend mit der größten Drüse auf der Schläfenseite des Augenlids nummeriert (Abb. 3a). In dieser Studie analysierten wir Drüsen, die sich vorzugsweise an einer ähnlichen mittleren Position in der Fußwurzelplatte befanden, wie in Abb. 3a, b dargestellt, bei Mutanten- und Kontrollmäusen.

a Um den Vergleich ähnlicher MGs zu erleichtern, wurden die MGs von der temporalen Seite (MG#1) bis zur nasalen Seite (MG#11) nummeriert. Der eingerahmte Bereich gibt die Region an, in der MGs für alle folgenden Experimente untersucht wurden. b Die gesamte Tarsalplatte des Mount bei P3 wurde durch konfokale Mikroskopie abgebildet. MGs wurden mit einem Antikörper gegen K14 (in Weiß) gefärbt. Haarfollikel (mit * markiert) waren ebenfalls gefärbt, konnten jedoch aufgrund des Vorhandenseins eines Haarschafts leicht von MGs unterschieden werden. Der eingerahmte Bereich gibt den MG an, der bei höherer Vergrößerung in c und d dargestellt ist. Maßstabsbalken, 100 µm. c 3D-Rekonstruktion mit Imaris von MG#7 In Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP-Mäusen markiert mCherry primäre Zilien rot und GFP markiert Basalkörperchen grün. Bei P3 waren entlang des gesamten MG Flimmerhärchen sichtbar. Maßstabsbalken, 15 µm. d Optischer Abschnitt in der Mitte von MG#7. Basalkörper (in Grün) und primäre Zilien (in Rot) waren auf der apikalen Seite der MG-Basalzellen lokalisiert (umrandet mit einer gelben gepunkteten Linie). Maßstabsbalken, 15 µm. e Repräsentativer MG-Längsschnitt bei P6. MGs (umrandet durch eine gelbe gepunktete Linie) wurden mit einem Antikörper gegen K14 (in Weiß) gefärbt, Kerne wurden mit DAPI (in Blau) gefärbt, Basalkörper wurden mit GFP (in Grün) markiert und primäre Zilien wurden mit mCherry (in) markiert Rot). MG-Zellen sind entlang der gesamten MG bewimpert, einschließlich in der distalen Spitze der Drüse (i), den sich bildenden Azini (ii) und dem sich bildenden zentralen Ductus (iii). Maßstabsbalken, 15 µm. f Repräsentativer Längsschnitt eines morphologisch ausgereiften MG bei P25. MGs (umrandet durch eine gelbe gepunktete Linie) wurden mit einem Antikörper gegen K14 (in Weiß) gefärbt, Kerne wurden mit DAPI (in Blau) gefärbt, Basalkörper wurden mit GFP (in Grün) markiert und primäre Zilien wurden mit mCherry (in) markiert Rot). In den Acini (i) waren keine primären Flimmerhärchen sichtbar, aber in den Ductuli (ii) und dem zentralen Ductus (iii) waren noch primäre Flimmerhärchen (Pfeile) vorhanden. Maßstabsbalken, 100 µm; Ac, Acini; CD, zentraler Kanal. g Quantifizierung des Prozentsatzes an Flimmerzellen während der gesamten Entwicklung (n = 3 für jedes Alter). Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Kruskal-Wallis-Tests bewertet. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden in der Grafik nur statistisch signifikante Unterschiede angezeigt. h Räumliche Verteilung der Flimmerzellen innerhalb der MGs bei P12 und P25. Der Prozentsatz der Flimmerzellen wurde spezifisch in den Acini und im zentralen Ductus der MGs bei P12 und P25 quantifiziert (n = 3 für jedes Alter). Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests (Strg vs. cKO) und des Wilcoxon-Signed-Rang-Tests (Acini vs. Ductus) bewertet. ns, nicht signifikant, P ≥ 0,05.

Bei P3 zeigten mehr als 70 % der MG-Zellen primäre Zilien, die von der apikalen Seite der Basalzellen in die Mitte der sich entwickelnden Drüse reichten (Abb. 3c, d, g). Ein ähnlicher Anteil der MG-Zellen war während der frühen MG-Verzweigung bei P6 und P8 bewimpert (Abb. 3e, g). Bei P6 waren primäre Zilien in der sich verlängernden distalen Spitze, dem sich entwickelnden Gang und den knospenden Azini sichtbar; Basalkörper reifer Meibozyten in der Mitte des zentralen Ductus wiesen jedoch keine Zilien auf (Abb. 3e, gelbe Pfeilspitzen). Mit fortschreitender Reifung der MGs sank der Anteil der Flimmerzellen bei P12 und P25 zunehmend auf 30 % bzw. 12 % (Abb. 3g). Der Prozentsatz der Flimmerzellen war im Gang und in den Acini von MGs bei P12 ähnlich (Abb. 3h); Bei P25 fehlten jedoch primäre Zilien in Acini (Abb. 3f, h). Bei P25 wurden die meisten primären Zilien auf den Basalzellen der proximalen Region des zentralen Ductus nachgewiesen. Dennoch waren gelegentlich auch einige auf den Basalzellen der Verbindungsgänge sichtbar (Abb. 3f). Somit lokalisierten sich primäre Zilien in den Basalzellen der sich entwickelnden MGs und zerfielen mit fortschreitender MG-Entwicklung und Reifung der Meibozyten. Zilien blieben jedoch auf den Basalzellen des zentralen Gangs reifer Drüsen bestehen. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Zilien während eines frühen Entwicklungsschritts der MG-Morphogenese eine Rolle spielen, an der hauptsächlich sich teilende und undifferenzierte Zellen beteiligt sind.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass eine primäre Zilienresorption für die Zellproliferation erforderlich ist, und haben gezeigt, dass die primären Zilien bei verschiedenen epithelialen Neoplasien entweder reduziert oder verloren gehen (Übersicht in 39, 40, 41). Daher untersuchten wir, ob die abnormale Größenausweitung der MGs der Zilienmutante auf einen Anstieg der Zellproliferationsraten zurückzuführen ist. Die Proliferationsraten wurden durch Zählen der Anzahl der EdU-positiven Zellen 6 Stunden nach der EdU-Injektion bestimmt und auf die Gesamtzahl der durch DAPI-Kernfärbung identifizierten Zellen normalisiert. Um die Proliferationsraten der Drüsen genau zu bestimmen, haben wir EdU-positive und DAPI-positive Zellen auf Serienschnitten des Augenlids gezählt und dabei die gesamte MG-Dicke für jede Drüse abgedeckt. Die Zellproliferationsraten wurden bei P4, P6 und P21 bewertet, wenn sich die MGs verlängerten, zu verzweigen begannen und ihre reife Morphologie erreichten10. Der Gesamtprozentsatz der sich teilenden Zellen in MGs sowohl der Mutanten- als auch der Kontrollmäuse betrug bei P4 ~40 %, sank bei P6 auf ~25 % und erreichte bei P21 Ausgangswerte von ~5 %, wobei bei Kontroll- und cKO-Mäusen keine signifikanten Unterschiede festgestellt wurden Jeder der analysierten Zeitpunkte (Abb. 4a – d).

a–c Die Zellproliferation wurde durch EdU-Färbung in MGs bei P4, P6 und P21 in Kontrollmäusen (a, b und c) bzw. cKO-Mäusen (a', b' und c') bewertet. Maßstabsbalken, 100 µm; *, Haarbalg; Ulme, Lidrand; d, distal; p, proximal. d–e Die Proliferationsraten wurden bei P4, P6 und P21 in den vollständigen MGs (d) und insbesondere in der proximalen (p) Hälfte (vom Augenlidrand bis zur Mitte der Drüse) und der distalen (d) Hälfte quantifiziert ( von der Mitte bis zur Spitze der Drüse) von MGs e. Die Proliferationsraten wurden durch Normalisierung der Anzahl der EdU-positiven Kerne auf die Gesamtzahl der durch DAPI gefärbten Kerne (n = 4/Gruppe) bestimmt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests (Strg vs. cKO) und des Wilcoxon-Signed-Rang-Tests (distal vs. proximal) bewertet. ns, nicht signifikant, P ≥ 0,05. (f) Der Zelltod wurde durch TUNEL-Färbung in MGs bei P21 bei Kontrollmäusen (f) bzw. cKO-Mäusen (f') beurteilt. Maßstabsbalken, 100 µm; *, Haarbalg; Ulme, Lidrand; d, distal; p, proximal. (g–h) Die Zelltodraten wurden bei P21 in den vollständigen MGs (g) und speziell im zentralen Ductus (h) quantifiziert. Die Zelltodraten wurden durch Normalisierung der Anzahl TUNEL-positiver Kerne auf die Gesamtzahl der gefärbten Kerne bestimmt DAPI (n = 3/Gruppe). Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests (gesamt, Strg vs. cKO) und des Wilcoxon-Signed-Rank-Tests (distal vs. proximal) bewertet. ns, nicht -signifikant, P ≥ 0,05.

Darüber hinaus untersuchten wir die Verteilung proliferierender Zellen entlang der proximal-distalen Achse der Drüsen. Bei Kontrollmäusen teilten sich 52 % bzw. 28 % der Zellen in der distalen Hälfte der Drüse bei P4 bzw. P6. Im Gegensatz dazu vermehrten sich bei Kontrollmäusen bei P4 bzw. P6 nur 32 % bzw. 22 % der Zellen in der proximalen Hälfte der Drüse. Daher waren während der Entwicklung von Kontroll-MGs proliferierende Zellen im distalen Bereich häufiger anzutreffen als im proximalen Bereich (Abb. 4a, b, e). Im Gegensatz dazu waren proliferierende Zellen im Mutanten gleichmäßig über die Länge der Drüsen verteilt (Abb. 4a', b', e). Bei P21 war die distale Anreicherung proliferativer Zellen entlang der proximo-distalen Achse nicht mehr sichtbar (Abb. 4c, e). Somit veränderte die primäre Zilienablation während der MG-Entwicklung nicht die Gesamtzellproliferationsrate, sondern hatte stattdessen einen Einfluss auf die bevorzugte Konzentration der sich teilenden Zellen auf die distale Hälfte der Drüsen. Allerdings unterschied sich die Anzahl der mit einem primären Cilium assoziierten Basalkörperchen zwischen der distalen und der proximalen Hälfte der MGs bei P3, P6 und P8 nicht signifikant (Ergänzung Abb. 3).

Als nächstes untersuchten wir, ob die bei der Zilienablation beobachtete Störung der Drüsenarchitektur die Anzahl oder Verteilung der apoptotischen Zellen in ähnlicher Weise veränderte. Wir haben den Prozentsatz apoptotischer Zellen in reifen MGs bei P21 durch TUNEL- und DAPI-Färbung quantifiziert. Der Gesamtprozentsatz der TUNEL-positiven (TUNEL + ) Zellen, die in den Duktuli, Azini und dem zentralen Drüsengang, wo sich die Mehrheit der apoptotischen Zellen befand, nachgewiesen wurden, war sowohl bei Kontrollmäusen als auch bei cKO-Mäusen ähnlich (Abb. 4f, g). Obwohl wir im MG sowohl der Kontroll- als auch der cKO-Mäuse keine räumliche Segregation apoptotischer Zellen feststellen konnten (Abb. 4g), war ein höherer Prozentsatz der TUNEL + -Zellen in der distalen Hälfte lokalisiert als in der distalen Hälfte, wenn wir nur den zentralen Drüsengang betrachteten die proximale Hälfte bei Kontrollmäusen (Abb. 4h). Im Gegensatz dazu waren im zentralen Ductus von cKO-Mäusen apoptotische Zellen gleichmäßig zwischen der distalen und proximalen Hälfte der Drüsen verteilt (Abb. 4h). Somit hat die Ablation primärer Zilien keinen Einfluss auf die Zelltodrate, sondern beeinflusst stattdessen die Lokalisierung von TUNEL+-Zellen im MG-Zentralgang. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Fehlen von Zilien eher die Verteilung sich teilender und apoptotischer Zellen als die Gesamtraten der Proliferation und des Zelltods beeinflusst, was anschließend die Architektur und Größe mutierter MGs verändert.

Um festzustellen, wie sich das Fehlen von Zilien auf die MG-Morphogenese auswirkt und zu ungewöhnlich größeren Drüsen führt, untersuchten wir die Bildung von Zellmustern während früher morphogenetischer Schritte der MG-Entwicklung. Der mG-Reporter, der bei der Cre-abhängigen homologen Rekombination in der mT/mG-Maus exprimiert wurde, ermöglichte es uns, die MG-Morphogenese bei der Zellauflösung sowohl in der Mutante als auch in der Kontrolle zu verfolgen. Bei P1, als sich die epitheliale Einstülpung vom Augenlidrand in das Augenlidmesenchym ausdehnt, zeigten die Meibom-Anlagen der Mutante eine ähnliche Größe und Gesamtform wie die in der Kontrolle beobachteten Anlagen (Abb. 5a, b). Während jedoch die Zellen der invaginierenden Epithelanlage unter Kontrolle in einer Schicht aus Basalzellen, die eine Schicht aus Suprabasalzellen umgab, gut organisiert zu sein schienen, schien dieses Zellmuster bei der Mutante weniger definiert zu sein und die Basal- und Innenschichten waren nicht klar erkennbar (Abb . 5a, b). Mit fortschreitender Morphogenese waren die Primordien der Mutante durch P3 MG kürzer, aber breiter als die der Kontrolle (Abb. 5c – g). Darüber hinaus war das Verhältnis der Anzahl der Basalzellen im Vergleich zur Anzahl der Zellen im Zentrum der Drüse bei cKO-Mäusen signifikant verringert, was darauf hindeutet, dass sich im zentralen Teil der cKO-MGs mehr Zellen befanden (Abb. 5h, i).

a–b Repräsentative Übersicht über die gesamten Tarsalplatten des Mount bei P1, abgebildet durch konfokale Mikroskopie. MGs wurden durch den mG-Fluoreszenzreporter sichtbar gemacht. Eingerahmte Bereiche zeigen MGs mit höherer Vergrößerung an, für die serielle optische Schnitte angezeigt werden. Maßstabsbalken, 50 µm. c–d Ein repräsentativer Überblick über die gesamten Tarsalplatten des Mount bei P3, abgebildet durch konfokale Mikroskopie. MGs wurden durch den mG-Fluoreszenzreporter sichtbar gemacht. Eingerahmte Bereiche zeigen MGs an, die in e bei höherer Vergrößerung dargestellt sind. Maßstabsbalken, 50 µm. MG-Länge (f) und MG-Breite (g) von cKO-Mäusen normalisiert zur Kontrolle (n = 5 Mäuse/Gruppe). Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests bewertet. h Basalzellen (in Lila) und Zentralzellen (in Blau) wurden manuell farbcodiert und dann gezählt. i Das Verhältnis zwischen Basalzellen und Zentralzellen wurde berechnet (n = 5 Mäuse/Gruppe). Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests bewertet.

Während sich MGs weiterentwickeln, dehnen sich Zellen im zentralen Strang des Epithels bei P6 aus, der zentrale Gang beginnt sich zu bilden und seitliche Zweige erscheinen10. Bei P6 und P21 war die Breite des mutierten Zentralgangs 10 % bzw. 30 % größer als bei der Kontrolle (Abb. 6a – d). Da Zellproliferation, Apoptose und Zellgröße in den MGs sowohl der Mutante als auch der Kontrolle unverändert blieben, gingen wir davon aus, dass die Gesamtmasse der Drüsen in beiden Genotypen zumindest in frühen Entwicklungsstadien ähnlich bleiben würde. Mithilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie an Ganzkörperproben von Fußwurzelplatten fanden wir keine signifikanten Unterschiede im durchschnittlichen Gesamtvolumen zwischen Mutanten- und Kontroll-MGs bei P1, P3 oder P4 (Abb. 6e, f). Im Gegensatz dazu war bei P8 das durchschnittliche Volumen der mutierten Drüsen fast doppelt so hoch wie das der Kontrolldrüsen (Abb. 6g, h). Schließlich unterschied sich die Anzahl der Acini zwischen beiden Genotypen nicht signifikant (Abb. 6i). Somit fördern primäre Zilien die Segregation proliferierender Zellen an der distalen Spitze der wachsenden MGs, was wiederum ein ausgewogenes Wachstum in Länge und Breite des MG-Gangs gewährleistet (Abb. 6j). Um festzustellen, ob die Ablation von Zilien das Ergebnis bekannter Zilien-vermittelter Signalkaskaden beeinträchtigt, untersuchten wir die Expressionsniveaus ausgewählter Gene, von denen bekannt ist, dass sie Transkriptionsziele oder wesentliche Komponenten der Hedgehog- (Hh-), Wnt- oder Notch-Signalwege in der Fußwurzelplatte von Erwachsenen sind cKO- und Kontrollmäuse durch quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR). Die in der Mutante nachgewiesenen Expressionsniveaus von Genen, die mit den Wnt- und Notch-Signalkaskaden assoziiert sind, waren nicht von denen in der Kontrolle zu unterscheiden (Abb. 6k). Im Gegensatz dazu stellten wir im Mutanten im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Verringerung der mRNA-Spiegel des Gli1-Gens, eines Transkriptionsfaktors und Transkriptionsziels des Hh-Signalwegs, fest (Abb. 6k). Allerdings blieben die Expressionsniveaus zusätzlicher Gene des Hh-Signalwegs, einschließlich der Hh-Liganden Desert (Dhh), Indian (Ihh) und Sonic Hedgehog (Shh) sowie der Transkriptionsziele, einschließlich CyclinD und Ptch1, in beiden Fällen unverändert. Zukünftige Studien zur Einzelzellanalyse werden unser Verständnis der Rolle primärer Zilien bei der MG-Morphogenese und -Erneuerung verbessern.

a–d Repräsentative MG-Längsschnitte bei P6 (a) und P21 (c) und Quantifizierung des zentralen Kanaldurchmessers bei P6 (b) und P21 (d). MGs wurden durch den mG-Fluoreszenzreporter sichtbar gemacht und der Durchmesser des zentralen MG-Gangs (umrandet durch weiße gepunktete Linien) wurde gemessen (n = 5 Mäuse/Gruppe). Maßstabsbalken, 100 µm. e Repräsentative Übersicht über die gesamten Tarsalplatten des Berges bei P3, aufgenommen mit 2-Photonen. Maßstabsbalken, 100 µm. f Das MG-Volumen bei P1, P3 und P4 wurde nach 3D-Rekonstruktion von Z-Stapeln mit Imaris quantifiziert (n = 4 Mäuse/Gruppe bei P1, n = 5 Mäuse/Gruppe bei P3 und n = 3 Mäuse/Gruppe bei P4). Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Kruskal-Wallis-Tests bewertet. ns, nicht signifikant, P ≥ 0,05. g Repräsentative Übersicht über die gesamten Tarsalplatten des Berges bei P8, aufgenommen mit 2-Photonen. Maßstabsbalken, 100 µm. Das h-MG-Volumen bei P8 wurde nach 3D-Rekonstruktion von Z-Stapeln mit Imaris (n = 4 Mäuse/Gruppe) quantifiziert. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Kruskal-Wallis-Tests bewertet. ns, nicht signifikant, P ≥ 0,05. Die i-MG-Verzweigung wurde durch Zählen der Anzahl der Acini pro Drüse bei P8 (n = 5 Kontrollen und n = 4 cKO) beurteilt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests bewertet. ns, nicht signifikant, P ≥ 0,05. (j) Modell der MG-Morphogenese und Zellmusterbildung während der frühen Entwicklung (von P1 bis P3) in cKO und Kontrolle. k RT-qPCR-Analyse der Zielgene Hh (Dhh, Ihh, Shh, CyclinD, Gli1, Ptch1), Notch (Hes1, Hey1, Maml1, Notch1) und Wnt (Axin2) in isolierten Tarsalplatten von cKO und Kontrolle zeigt eine signifikante Herunterregulierung von Gli1-Expression in mutiertem Gewebe im Vergleich zur Kontrolle im Erwachsenenalter (n = 7 Kontrollen und n = 5 cKO). Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests bewertet. ns, nicht signifikant, P ≥ 0,05.

Die Hauptfunktion der MGs besteht darin, das Meibum abzusondern, eine Lipidschicht, die die Augenoberfläche vor gefährlichen Umweltfaktoren und Austrocknung schützt1,42,43. Mehrere Faktoren können zu Funktionsstörungen von MGs führen, für die es keine wirksamen Langzeitbehandlungen gibt. Trotz ihrer entscheidenden Rolle bei der Aufrechterhaltung einer klaren Sicht sind die molekularen Mechanismen und Signalnetzwerke, die der Entwicklung und Aufrechterhaltung von MGs zugrunde liegen, noch wenig verstanden. Unsere Studie enthüllt die entscheidende Rolle der primären Zilien bei der Kontrolle der Größe von MGs und der Menge des produzierten Meibums. Diese Ergebnisse werfen Licht auf die grundlegenden Mechanismen der MG-Entwicklung und -Aufrechterhaltung und haben wichtige Auswirkungen auf die Gestaltung von MGD-Behandlungen. Hier haben wir gezeigt, dass eine mutierte Maus ohne Zilien durch Ablation des Ift88-Gens in K14-exprimierendem Gewebe ungewöhnlich große MGs entwickelt, die doppelt so viele Lipide wie üblich enthalten. Eine Vergrößerung der Drüse konnte jedoch nicht durch Veränderungen der Proliferations- oder Apoptoseraten erreicht werden. Stattdessen haben wir gezeigt, dass die Ablation von Zilien in sich entwickelnden Drüsen die Zellorganisation und die Lokalisierung sich teilender Zellen entlang ihrer proximal-distalen Achse veränderte, ihre Zellstruktur veränderte und zu einer Vergrößerung der Drüsendimensionen führte.

Anhand eines transgenen Mausmodells mit fluoreszierend markierten Zilien und Basalkörpern haben wir gezeigt, dass primäre Zilien vor allem während der frühen MG-Entwicklung auf Meibozyten vorhanden waren. Um zu erklären, wie Entwicklungsprozesse in K14-exprimierendem Gewebe mit Zilienmangel bei erwachsenen Mäusen zu größeren MGs führten, ohne dass sich die Proliferations- oder Apoptoseraten veränderten, haben wir die Morphogenese und Zellmusterung der sich entwickelnden MGs in Kontroll- und cKO-Mäusen untersucht. Wir fanden heraus, dass bei P1 das Zellmuster der Kontrolldrüsen, die aus dem verschmolzenen Augenlidrand hervorsprossen, in einer angrenzenden Schicht aus Basalzellen und einer Schicht aus suprabasalen Zellen in der Mitte der sich verlängernden Knospe organisiert zu sein schien. Im Gegensatz dazu war dieses Zellmuster in den MG-Knospen der Zilienmutante gestört, wo die Zellen zufällig organisiert mit schlecht erkennbaren Schichten erschienen (Abb. 5). Bei P3 stülpte sich der feste Epithelstrang weiter in das Mesenchym der Fußwurzelplatte ein, und die Anzahl der zentralen/suprabasalen Schichten erhöhte sich auf 2 oder 3. Während der Elongationsphase zwischen P4 und P6 lokalisierte sich der Großteil der sich teilenden Zellen an der Fußwurzelplatte distale Spitze der sich entwickelnden Drüsen der Kontrolle, waren jedoch gleichmäßig über die Länge der Drüsen im Mutanten verteilt. Daher könnten die Zilien der MGs für die Erfassung mitogener Signale, die für die proximo-distale Verlängerung erforderlich sind, von entscheidender Bedeutung sein. Wir gehen davon aus, dass ein Versäumnis, sich teilende Zellen in der wachsenden Drüse räumlich zu trennen, den Dehnungsprozess an der distalen Spitze der Drüsen beeinträchtigen könnte. Da kein Unterschied in der Proliferation festgestellt wurde, würde ein langsameres Wachstum an der distalen Spitze folglich zu einer abnormalen seitlichen Ausdehnung der einstülpenden Epithelstränge führen. Tatsächlich fanden wir heraus, dass die Anzahl der zentralen/suprabasalen Zellschichten in der Drüse der Zilienmutante ungewöhnlich auf 4 oder 5 anstieg und die sich entwickelnden Drüsen daher sowohl breiter als auch kürzer waren als die Kontrolldrüsen. In Übereinstimmung mit dieser Möglichkeit blieb das Gesamtvolumen der Drüsen sowohl bei der Mutante als auch bei der Kontrolle bis mindestens P4 ähnlich (siehe Modell in Abb. 6j). Bei P8 nahm das Volumen der mutierten MGs im Vergleich zur Kontrolle signifikant zu; allerdings war die Drüsenlänge bei beiden ähnlich. Daher gehen wir davon aus, dass beim Wachstum der Drüsen hemmende Signale ihre Verlängerung behindern könnten, die schließlich bei der vollständigen morphologischen Reifung der Drüsen zum Stillstand kommt (P15). Während die Kontroll-MGs aufhörten, sich zu verlängern, wuchsen die mutierten Drüsen weiter und erreichten schließlich die Länge der Kontrolldrüsen. Da jedoch der zentrale Gang in den mutierten Drüsen größer war, waren die Gesamtgröße und der Lipidgehalt der mutierten MGs im Vergleich zur Kontrolle erhöht. Ähnliche Dynamiken könnten auch bei der Entstehung der Ductuli auftreten. Zukünftige Studien zur Aufklärung der Rolle der primären Zilien bei der Bestimmung der Lokalisierung sich teilender Zellen an der distalen Spitze des sich entwickelnden MG könnten eine neue Rolle der Zilien bei der Gewebemorphogenese aufzeigen.

Im Gegensatz zu SGs sind MGs nicht strukturell mit dem Haarfollikel verbunden1. Es ist jedoch unklar, ob die Haarfollikel der Wimpern, die die MGs interkalieren, deren Entwicklung oder Homöostase beeinflussen. In der Haut führt die Ablation von ziliogenen Proteinen in K14-exprimierendem Gewebe zur Degeneration der Haarfollikel durch Inaktivierung des Hh-Signalwegs23,29,44. Defekte in der Haarfollikelbildung und -erhaltung waren jedoch bereits drei Wochen nach der Geburt erkennbar, ein Zeitpunkt, an dem die MGs bereits ihre ausgereifte Konfiguration erreicht hatten23. Daher können wir jegliche indirekte Rolle der Haarfollikel bei zilienabhängigen Defekten, die die MGs betreffen, ausschließen, wie in dieser Studie berichtet. Es ist allgemein anerkannt, dass das Ziliarkompartiment für die Ausbreitung des Hh-Signalwegs erforderlich ist und dass die Ablation von Ift88 die Hh-Reaktionsfähigkeit in mehreren Geweben hemmt. Dementsprechend konnten wir im Vergleich zur Kontrolle verringerte mRNA-Spiegel des Transkriptionsfaktors und des Transkriptionszielgens Gli1 in der mutierten Fußwurzelplatte feststellen. Studien an der Haut haben gezeigt, dass der Hh-Signalweg für die Entwicklung von SG entscheidend ist, die mehrere grundlegende Merkmale mit den MGs teilen47. Daher stimmen unsere Ergebnisse, die eine abnormale Vergrößerung von MGs mit Zilienmangel durch Ift88-Ablation zeigen, möglicherweise nicht mit der Hh-vermittelnden MG-Entwicklung überein. Interessanterweise beeinträchtigte die Ablation von Zilien in K14-exprimierenden Zellen jedoch das Haarwachstum und die Haarerhaltung durch die Erschöpfung des Hh-Signals, führte aber auch zu einem vergrößerten und multilobulierten SG im Mausschwanz23. Somit deuten diese Beweise auf eine ungewöhnliche und komplexe Beteiligung von Zilien an der Zilien-Hh-Signalachse in SGs und MGs hin. Eine gründliche Untersuchung dieser Wechselwirkung könnte grundlegende mechanistische Erkenntnisse für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Behandlung sowohl von Hauterkrankungen im Zusammenhang mit Ciliopathien wie Keratosis pilaris und seborrhoischer Dermatitis als auch von MGD32 liefern.

Hier haben wir gezeigt, dass Meibozyten mit zunehmender Reife ihr primäres Cilium verlieren. Ähnlich wie bei anderen Epithelien, einschließlich der Epidermis und dem Hornhautepithel, waren Zilien auf Basalzellen vorhanden, zerfielen jedoch, als sich die Zellen differenzierten und nach apikal bewegten22,23,24. In reifen Drüsen waren Flimmerzellen auf den proximalen Bereich des zentralen Ductus und auf die Basalschicht der Ductuli und Acini beschränkt. Interessanterweise wurde gezeigt, dass sich bei erwachsenen MGs sich langsam teilende Zellen, die eine Stammzellcharakteristik widerspiegeln, in den Ductuli an der Stelle ansiedeln, an der der zentrale Ductus in die Acini übergeht48. Daher wäre es interessant zu bestimmen, ob langsam zyklische Zellen bewimpert sind. In der Haut spielen primäre Zilien eine Hh-unabhängige interfollikuläre Rolle bei der Schichtung der Epidermis bei der Homöostase23,24. Die Ablation von Ift88 erhöhte die Proliferationsraten und führte zu einer Erweiterung der Basalschicht mit basalähnlichen Zellen. Allerdings führte die Hyperproliferation nicht zur Bildung von Tumoren oder Blasen23. Dies steht im Gegensatz zu unserer Feststellung, dass die Ausbreitung von MG nicht mit einer Erhöhung der Proliferationsrate einhergeht. Es muss jedoch beachtet werden, dass die Ablation von Ift88 in stark proliferierendem Hornhautepithel während der Entwicklung oder Reparatur keinen Einfluss auf die Proliferationsraten hatte22. Dies deutet darauf hin, dass die Zellproliferation ein sekundärer und indirekter Effekt der Zilienablation sein könnte. Interessanterweise modulierten in der Haut und Hornhaut primäre Zilien epithelialer Basalzellen den Notch-Signalweg unabhängig von der Zellproliferation22,24. Obwohl unsere Ergebnisse der RT-qPCR von Tarsalplattengewebe darauf hindeuten, dass das primäre Cilium in MGs erwachsener Mäuse nicht für die Transduktion des Notch-Signals erforderlich ist, ist es möglich, dass potenzielle Unterschiede in den mRNA-Spiegeln der Notch-Zielgene zwischen Mutante und Kontrolle bestehen erkennbarer Spielraum dieses Ansatzes. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass in reifen MGs nur eine kleine Anzahl von Zellen mit Flimmerhärchen versehen bleibt. Zukünftige Studien auf Einzelzellebene könnten daher ein umfassenderes Verständnis der Beteiligung von Zilien an der Notch- und MG-Aufrechterhaltung liefern. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die Unterdrückung des Notch-Signalwegs in Vorläuferzellen von SGs zu einer Atrophie der Drüse führte49. Im Gegensatz dazu trieb die Notch-Ablation außerhalb des Stammzellkompartiments die SG-Expansion voran49. In einer anderen Studie führte die Ablation von Notch1 in K14-exprimierendem Gewebe zur Bildung zystenartiger Strukturen, die die MGs50 ersetzten. Daher wäre es interessant, eine mögliche Beteiligung des primären Ciliums an der Transduktion des Notch-Signalwegs auf Einzelzellebene im Zusammenhang mit der Aufrechterhaltung der Stammzellnische in MGs51 zu bestimmen.

Die Lipidanalyse hat gezeigt, dass die Ablation von Zilien während der MG-Entwicklung zu einem zweifachen Anstieg des Lipidgehalts führte. Obwohl wir die Beteiligung von Zilien an der Regulierung der MG-Größe nachgewiesen haben, bleibt unklar, ob die Zilien auch eine direktere Rolle bei der Meibumproduktion spielen. Der Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor-γ (PPARγ) ist ein Mitglied der Kernrezeptorfamilie ligandenaktivierter Transkriptionsfaktoren, die an der Regulierung der Adipozyten- und Sebozytendifferenzierung sowie der Lipogenese beteiligt sind52,53. Darüber hinaus ist PPARγ auch an der Differenzierung von Meibozyten in vivo und in vitro beteiligt und wird für die Hochregulierung von Genen benötigt, die an der Lipidproduktion beteiligt sind54,55,56. Jüngste Studien haben gezeigt, dass im Zusammenhang mit der verletzungsbedingten Adipogenese die Ablation von Zilien in fibro-/adipogenen Vorläuferzellen (FAP) durch Ift88-Deletion die Produktion von PPARγ und die FAP-Differenzierung in Adipozyten hemmte57,58. Diese Studien würden gegen eine direkte Beteiligung der MG-Zilien an der PPARγ-abhängigen Lipogenese oder Meibozytendifferenzierung sprechen, da die Ablation der Zilien in MGs zu einem Anstieg der Lipidmenge und einer Vergrößerung der Meibozytenmasse führte. Im Gegensatz zu den meisten Zelltypen hemmen jedoch primäre Zilien von FAPs und Zellen in der sich entwickelnden Extremitätenknospe die GLI1- und PATCHED1-Expression, indem sie die Bildung des GLI3-Repressors fördern. Folglich führte die Ablation von Zilien eher zu einer Zunahme als zu einer Abnahme der Hh-Signalaktivität59. Mehrere Studien haben die komplexe Rolle des Hh-Signalwegs bei der Adipogenese und der PPARγ-Regulation gezeigt60,61,62,63. Daher werden zukünftige Untersuchungen, die sich mit der Rolle von GLI-Proteinen und allgemeiner mit der Rolle des Hh-Signalwegs bei der Entwicklung und Homöostase von MGs befassen, wichtige mechanistische Einblicke in unser Verständnis der Meibozytendifferenzierung, -erneuerung und -meibogenese liefern.

Bisher sind die Behandlungsmöglichkeiten für MGD und KCS begrenzt. Physikalische Behandlungen, die darauf abzielten, die Qualität und Quantität des Meibums zu steigern, erzielten langfristig keine zufriedenstellenden Ergebnisse64,65,66. Andere Ansätze, die darauf abzielen, die Lipidschicht durch die topische Anwendung von lipidhaltigen künstlichen Tränen und Emulsionen zu ersetzen, stellen angesichts der komplexen Struktur und Zusammensetzung der Lipidschicht der Augenoberfläche eine Herausforderung dar.42,67 Daher ist die Erweiterung der Behandlungsstrategien durch direktes Ansprechen auf die MG-Erneuerung und Lipidproduktion eine Herausforderung haben das Potenzial, nicht nur Beschwerden an der Augenoberfläche zu lindern, sondern auch die Lebensqualität betroffener Patienten zu verbessern. Diese Arbeit ergab, dass durch Zilien vermittelte Wege die MG-Expansion und Lipidproduktion steuern, ohne die Lipidzusammensetzung zu beeinflussen, was auf ein neues therapeutisches Ziel zur Bekämpfung von MGD hinweist.

Mausstämme Ift88tm1Bky (hier als Ift88fl/fl bezeichnet)68, B6N.Cg-Tg(KRT14-cre)1Amc/J (K14-Cre, Jackson Laboratory stock No 018964)69 und Gt(Rosa)26Sor(tm4(ACTB -tdTomato,-EGFP)Luo)/J (mT/mG), Jackson Laboratory stock No 007676)34 wurden auf gemischten C57Bl/6-, FVB- und 129-genetischen Hintergründen gehalten. Die bedingten Ift88-Knockouts (cKO) wurden durch Kreuzung von K14-Cre;Ift88fl/+-Männchen mit Ift88fl/fl-Weibchen erzeugt. Andere Allelkombinationen als K14-Cre;Ift88fl/fl (cKO) wurden als Kontrollen betrachtet (Strg). Der Mausstamm Tg(CAG-Arl13b/mCherry)1 K und Tg(CAG-EGFP/CETN2)3-4Jgg/KandJ (hier als Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP bezeichnet)37 wurde im Jackson Laboratory gekauft (Bestellnummer 027967). . Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien und der Genehmigung des Animal Care and Use Committee der Johns Hopkins University sowie der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt.

Obere und untere Augenlider von P6- und P21-Mäusen wurden präpariert, über Nacht in 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS fixiert und zur histologischen Analyse in Paraffin eingebettet. Die Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung wurde nach Standardverfahren durchgeführt. Die Schnitte wurden mit einem Olympus-Diascanner VS200 (Olympus, Center Valley, PA) abgebildet. Augenlider von P3-Mäusen wurden präpariert, 30 Minuten bis 2 Stunden in 4 % PFA in PBS fixiert und in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA) eingebettet. Kryoschnitte wurden zur primären Ciliumfärbung verarbeitet. Nach 10-minütiger Fixierung mit kaltem Aceton (–20 °C) und 20-minütiger Permeabilisierung mit 0,5 % Triton Louis, MO) und/oder ein Kaninchen-Anti-ARL13B-Antikörper (1:800, 17711-1-AP, ProteinTech Group, Rosemont, IL) in 2 % BSA/0,1 % Triton X-100/PBS über Nacht bei 4 °C. Die Schnitte wurden dann in sekundären fluoreszierenden Antikörpern inkubiert: Esel-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor™ 647 (1:500, A-31573, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), Esel-Anti-Maus-Fluorescein (FITC) (1:200, 715–095). -150, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA) und Esel-Anti-Maus-Rhodamin (TRITC) (1:200, 715-025-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) in 2 % BSA/PBS für 2 Stunden. Die Schnitte wurden mit VECTASHIELD Antifade-Montagemedium (H-1000, Burlingame, CA) montiert und mit einem konfokalen Zeiss LSM880-Mikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland) abgebildet.

Augenlider von P1, P3, P4 und P8 K14-Cre;Ift88fl/fl;mT/mG-Mäusen (cKO) und K14-Cre;Ift88fl/+;mT/mG (Ctrl)-Wurfgeschwistern wurden präpariert und in 4 % PFA in PBS fixiert für 1 Stunde gewaschen und in PBS gewaschen. Bei der Fixierung wurden die meisten Bindegewebe und Muskeln, die die Fußwurzelplatte bedecken, manuell entfernt. MGs wurden in 90 % Glycerin montiert und mit einem konfokalen LSM880-Mikroskop (für Proben bei P1) oder einem LSM710/NLO-Zwei-Photonen-Mikroskop (für Proben bei P3, P4 und P8) abgebildet. Es wurden serielle optische Schnitte in Schritten von 1 oder 2 µm durch den gesamten MG aufgenommen. Das MG-Volumen wurde nach 3D-Rekonstruktion der Z-Stapel mit Imaris (Bitplane, South Windsor, CT) quantifiziert und die Anzahl der Acini pro MG manuell gezählt.

Augenlider von P6-, P8- und P21-Mäusen wurden präpariert, 1 Stunde lang in 4 % PFA in PBS fixiert und in PBS gewaschen. Bei der Fixierung wurden die meisten Bindegewebe und Muskeln, die die Fußwurzelplatte bedecken, entfernt. MGs wurden 1 Stunde lang in ORO-Lösung (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) bei Raumtemperatur (RT) gefärbt, mit destilliertem H2O gespült, in 90 % Glycerin montiert und mit einem Olympus MVX10-Präparierfernrohr (Olympus) abgebildet. Die MG-Größe wurde durch Mittelung der mit Fiji70 gemessenen MG-Fläche einzelner MGs bestimmt.

Augenlider von P3-, P6-, P8-, P12- und P25-Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP-Mäusen wurden präpariert und 1 Stunde lang in 4 % PFA/1 % Triton X-100 (Mallinckrodt Pharmaceuticals, Staines-upon-Thames, Vereinigtes Königreich) fixiert. in PBS. Anschließend wurden die Augenlider für die K14-Färbung ganzer MGs bearbeitet oder in die OCT eingebettet. Bei ganzen MGs wurden vor der Färbung die meisten Bindegewebe und Muskeln, die die Fußwurzelplatte bedecken, entfernt und die Fußwurzelplatten wurden 1 Stunde lang mit 2 % BSA/1 % Triton X-100/PBS bei RT permeabilisiert. MGs für Whole-Mount-Proben und Kryoschnitte wurden mit einem gegen K14 gerichteten polyklonalen Kaninchen-Antikörper (1:1000, 905301, BioLegend, San Diego, CA) gefärbt. Kerne wurden auf Kryoschnitten mit DAPI gegengefärbt. MG-Vollpräparate (P3, P6 und P8) und Kryoschnitte (P12 und P25) wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM880-Mikroskop abgebildet. Serielle optische Schnitte wurden in 1-µm-Schritten aufgenommen. Nach der 3D-Rekonstruktion der Z-Stapel mit Imaris wurden MGs mit dem Oberflächen-Tool umrissen und primäre Zilien und Basalkörper in MGs mit dem Spots-Tool gezählt. Centrin2-GFP-markierte Zentriolen wurden als ein einzelner Basalkörper betrachtet, wenn sie weniger als 2 µm voneinander entfernt waren. Da die Anzahl der Basalkörper der Anzahl der Zellkerne ähnlich war, wie in Ergänzung Abb. 4 gezeigt, wurde die Anzahl der Flimmerzellen in MGs durch Normalisierung der Anzahl der primären Zilien auf die Anzahl der Basalkörper bestimmt und als Prozentsatz ausgedrückt.

Mäuse in P4, P6 und P21 erhielten eine einzelne intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg EdU (EdU-Click 594, Baseclick, Deutschland) und wurden nach 6 Stunden getötet, wie an anderer Stelle beschrieben71. Die Augenlider wurden im OCT präpariert und eingefroren. 20-Mikron-Kryoschnitte wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet (EdU-Click 594, Baseclick, Deutschland). Kurz gesagt, die Schnitte wurden 15 Minuten lang mit 4 % PFA in PBS fixiert, 20 Minuten lang mit 0,5 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert und dann 30 Minuten lang mit dem Reaktionscocktail im Dunkeln bei RT gefärbt. MGs wurden mit dem mT/mG-Fluoreszenzreporter lokalisiert oder mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-K14-Antikörper (1:1000, 905301, BioLegend) gefärbt. Die Kerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Die Schnitte wurden mit einem Leica DMI6000-Mikroskop, das mit einer konfokalen Yokogawa-Spinnscheibe ausgestattet war, oder einem Zeiss LSM880-Konfokalmikroskop abgebildet. Für jeden Kryoschnitt wurden serielle optische Schnitte in 2,45-μm-Schritten aufgenommen. Für jede Maus wurden serielle Kryoschnitte durchgeführt, um die Gesamtheit der MGs zu erfassen. Nach der 3D-Rekonstruktion der Z-Stapel mit Imaris wurden MGs mit dem Oberflächen-Tool umrissen und EdU-positive Kerne und DAPI-positive Kerne in jedem MG mit dem Spots-Tool gezählt. Die Quantifizierung wurde an den MGs durchgeführt, die sich in der Mitte des oberen Augenlids befanden. Die Zellproliferationsrate pro MG wurde durch Normalisierung der Anzahl EdU-positiver Kerne auf die Anzahl DAPI-positiver Kerne bestimmt. Es wurde auch eine Quantifizierung der EdU-positiven und DAPI-positiven Kerne durchgeführt, wobei der proximale Teil (vom Augenlidrand bis zur Mitte der Drüse) und der distale Teil (von der Mitte der Drüse bis zur Spitze) der MGs getrennt wurden.

Augenlider von P21-Mäusen wurden präpariert, über Nacht mit 4 % PFA in PBS fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden für die Apoptose-Immunfluoreszenzfärbung mit dem In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red (Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland), wie in72 beschrieben, verarbeitet. Die Schnitte wurden 15 Minuten lang mit 10 µg/ml Proteinase K in 10 mmol/L Tris/HCl (pH 7,4) bei RT permeabilisiert und dann 1 Stunde lang mit der Reaktionsmischung bei 37 °C im Dunkeln gefärbt. Die Kerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Die Schnitte wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM880-Mikroskop abgebildet. TUNEL-positive und DAPI-positive Kerne wurden auf drei Serienschnitten im Abstand von 20 µm gezählt. Die Zelltodrate pro MG wurde durch Normalisierung der Anzahl TUNEL-positiver Kerne auf die Anzahl DAPI-positiver Kerne bestimmt.

Fußwurzelplatten wurden durch Präparation isoliert und sofort in RNAlater (AM7020, ThermoFisher, Waltham, MA) getaucht und bis zu 1 Monat bei –20 ° C gelagert. RNA wurde mit dem RNeasy Mini-Kit (Qiagen, Germantown, MD) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus Augenlidern extrahiert. Ein Mikrogramm RNA wurde mit dem SuperScript III-Reverse-Transkriptase-Kit (18080051, ThermoFisher) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers transkribiert. Die quantitative PCR wurde mit SYBR Green PCR Master Mix (4309155, ThermoFisher) in 20 µL in zweifacher Ausfertigung auf einem CFX96 qPCR (BioRad, Hercules, CA) in einem 2-Stufen-Zyklus mit einer Annealing-Temperatur von 60 °C durchgeführt. Die Quantifizierung erfolgte mit der 2-ΔΔcT-Methode73, wobei das geometrische Mittel von Gapdh und Polr2a als Normalisierung74 verwendet wurde. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Meibom-Lipide wurden aus chirurgisch herausgeschnittenen Fußwurzelplatten von Mäusen (4 von jeder Maus) bei 4 °C unter Verwendung von drei aufeinanderfolgenden Extraktionen mit einem Chloroform:Methanol-Lösungsmittelgemisch (3:1, Vol.:Vol.) extrahiert. Die Extrakte (3 x 1 ml) wurden gepoolt und das Lösungsmittel unter einem Strom von komprimiertem Stickstoff bei 37 °C verdampft. Der ölige Rückstand wurde in 1 ml Isopropanol in LC/MS-Qualität erneut aufgelöst und vor den Analysen in einem mit Stickstoff gespülten, mit Crimper verschlossenen HPLC-2-ml-Autoinjektorfläschchen bei –80 °C gelagert.

Die Analysen mit Gradienten- und isokratischer Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie/hochauflösender Flugzeit-Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck und chemischer Ionisation (LC/MS) wurden entsprechend mit einem Acquity UPLC C18 (1 mm × 100 mm; 1,7 µm Partikelgröße) durchgeführt Größe) und eine Acquity UPLC C8-Säule (2 mm × 100 mm; 1,7 µm Partikelgröße) (beide von Waters Corp., Milford, MA, USA), wie ausführlich in unseren früheren Veröffentlichungen für Maus- und Human-Meibum beschrieben75,76,77 . Pro Experiment wurden zwischen 0,5 und 1,0 µL der Probenlösung injiziert. Ein binäres Ultrahochleistungs-LC-System der Waters Acquity M-Class (UPLC, Waters Corp.) wurde mit einer Durchflussrate von 20 µL/min betrieben. Die Analyten wurden unter Verwendung isokratischer Lösungsmittelmischungen aus Acetonitril/Isopropanol mit 5 % 10 mM Ammoniumformiat als Zusatz eluiert. Die Analyten wurden mit einem hochauflösenden Synapt G2-Si QToF-Massenspektrometer [ausgestattet mit einer ZSpray-Schnittstelle, einer IonSabre-II-Ionenquelle für chemische Ionisierung bei Atmosphärendruck (APCI) und einer LockSpray-Einheit (alle von Waters Corp.)] nachgewiesen. Alle Experimente wurden im Positivionenmodus durchgeführt. Die meisten Lipide wurden als (M + H)+- und (M + H – H2O)+-Addukte nachgewiesen. Die wichtigsten Lipidanalyten wurden mithilfe der EleComp-Routine des Softwarepakets MassLynx v.4.1 (Waters Corp.) identifiziert. Einige der Verbindungen, beispielsweise Triacylglycerine und Cholesterylester, durchliefen jedoch eine spontane In-Source-Fragmentierung unter Bildung von (M + H − Fettsäure)+-Spezies und wurden zusätzlich als (M + Na)+, (M + K)+ charakterisiert und (M + NH4)+-Addukte. Abschließend wurden die chromatographischen Retentionszeiten und Massenspektren der wichtigsten Analyten mit denen authentischer Lipidstandards (sofern verfügbar) verglichen. Die Ergebnisse einer detaillierten Analyse des MG-Lipidoms mutierter Mäuse sind gesondert zu berichten.

Die Gesamtlipidproduktion von MGs wurde auf der Grundlage der Gesamtionenchromatogramme ihrer Lipidextrakte geschätzt, die in isokratischen LC/MS-APCI-Experimenten aufgezeichnet wurden, wie kürzlich beschrieben77. Die unvoreingenommene, ungezielte Analyse der Lipidomdaten wurde mit den Softwarepaketen Progenesis QI und EZinfo (Waters Corp.) durchgeführt. Der Ansatz der Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen den Kontroll- und cKO-Proben zu bewerten.

Für jedes Experiment wurden Kontroll- und cKO-Mutanten-Wurfgeschwister aus mindestens zwei verschiedenen Würfen verglichen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Der Mann-Whitney-Test wurde verwendet, um die cKO-Mutante mit den Kontrollmäusen zu vergleichen, der Wilcoxon-Signed-Rank-Test wurde verwendet, um verschiedene Regionen derselben Drüsen (Acini vs. Ductus und proximale vs. distale Hälften von MGs oder zentralen Ductus) zu vergleichen Der Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Post-hoc-Test wurde verwendet, um den Prozentsatz der Flimmerzellen pro Drüse während der MG-Entwicklung und das MG-Volumen während der MG-Entwicklung zu vergleichen. Statistische Tests wurden mit den Online-Web-Statistikrechnern https://astatsa.com/ oder RStudio78 durchgeführt. Ein AP-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten für die Haupt- und Zusatzzahlen werden als „Supplementary Data 1“ bereitgestellt. Zusätzliche Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor (CI) erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Qing Liu für sein Engagement in den frühen Phasen dieses Projekts, Hoku West-Foyle von der Microscope Facility an der Johns Hopkins für seine technische Unterstützung, der Referenzhistologie-Kerneinrichtung an der Johns Hopkins University für die Paraffinschnitte und den Mitgliedern von der Wilmer Cornea Group für ihre hilfreichen Beiträge und Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Eye Institute, National Institute of Health (EY030661 an CI, EY024324 und EY027349 an IB), einen Kernzuschuss des Wilmer Eye Institute (EY001765), einen Zuschuss des Office of Director, NIH ( S10RR024550 an SC Kuo, Mikroskopieeinrichtung der Johns Hopkins University); durch ein Stipendium der Familie Eisinger; von einem Wilmer Eye Institute Seed Fund an CI; und durch einen uneingeschränkten Zuschuss von RPB an das Wilmer Eye Institute.

Celine Portal

Aktuelle Adresse: Sorbonne-Universität, INSERM, CNRS, Vision Institute, 17 rue Moreau, F-75012, Paris, Frankreich

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yvonne Lin, Varuni Rastogi.

Abteilung für Augenheilkunde, Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, 21231, USA

Céline Portal, Yvonne Lin, Varuni Rastogi, Samuel Chi-Hung Yiu, James W. Foster und Carlo Iomini

Abteilung für molekulare und vergleichende Pathobiologie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, 21205, USA

Cornelia Peterson

Abteilung für Augenheilkunde, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, USA

Amber Wilkerson und Igor A. Butovich

Graduate School of Biomedical Sciences, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, USA

Igor A. Butovich

Abteilung für Zellbiologie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, 21231, USA

Carlo Iomini

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C.Portal., IB und CI konzipierten und gestalteten die Studie; C.Portal, YL, VR, JF, AW, IB und CI führten Experimente durch und analysierten und visualisierten Daten; C.Peterson und SY lieferten konzeptionelle und experimentelle Anleitung; IB und CI haben Fördermittel eingeworben; C.Portal, IB und CI haben das Papier mit Änderungen und Feedback aller Autoren verfasst. CI überwachte und verwaltete das Projekt.

Korrespondenz mit Carlo Iomini.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Duarte Barral und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Tiago Dantas und Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Portal, C., Lin, Y., Rastogi, V. et al. Primäre Zilien steuern die zelluläre Strukturierung der Meibom-Drüsen während der Morphogenese, nicht jedoch die Lipidzusammensetzung. Commun Biol 6, 282 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04632-5

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Eingegangen: 04. August 2022

Angenommen: 27. Februar 2023

Veröffentlicht: 17. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04632-5

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