Isolierung saprophytischer Fadenpilze aus Vogelkotproben und Bewertung ihrer räuberischen Aktivität auf Kokzidien-Oozysten

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8965 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Pilzstämme, die zur biologischen Bekämpfung tierischer Magen-Darm-Parasiten eingesetzt werden, wurden hauptsächlich aus Weideboden, verrottendem organischem Material und dem Kot von Pflanzenfressern und Fleischfressern isoliert. Ihre Isolierung aus Vögeln und die Bewertung ihrer räuberischen Aktivität gegen gastrointestinale Parasiten von Vögeln waren bisher jedoch nur spärlich. Ziel dieser Forschung war es, Fadenpilze aus Vogelkotproben zu isolieren und ihre räuberische Aktivität gegen Kokzidien zu bewerten. Ein Pool von 58 Kotproben von Hühnern, Legehennen und Pfauen, die zuvor zwischen Juli 2020 und April 2021 gesammelt wurden, wurde zur Isolierung von Fadenpilzen und zur Bewertung ihrer in vitro räuberischen Aktivität gegen Kokzidien-Oozysten unter Verwendung von Wasser-Agar-Medium und Koprokulturen verwendet . Die Willis-Flotationstechnik wurde ebenfalls durchgeführt, um konzentrierte Suspensionen von Oozysten zu erhalten. Insgesamt wurden sieben Mucor-Isolate erhalten, die einzigen identifizierten Pilztaxa, und alle zeigten lytische Aktivität gegen Kokzidien. Die Isolate FR3, QP2 und SJ1 hatten eine signifikante kokzidiostatische Wirksamkeit (Hemmung der Sporulation) von mehr als 70 %, während die Isolate FR1, QP2 und QP1 nach 14 Jahren eine kokzizide Wirksamkeit (Zerstörung der Oozysten) von 22 %, 14 % bzw. 8 % aufwiesen Die Inkubation dauert mehrere Tage und ist ein schrittweiser und zeitabhängiger Prozess. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht über die Isolierung einheimischer Raubpilze aus Vogelkot und den Nachweis ihrer lytischen Aktivität gegen Kokzidien.

Vogelkokzidiose ist eine der wichtigsten parasitären Krankheiten, die weltweit heimische und exotische Vögel befällt und für schwerwiegende gesundheitliche und wirtschaftliche Probleme in Geflügelfarmen, ornithologischen Parks und privaten Vogelsammlungen verantwortlich ist1,2,3,4,5.

Die Bekämpfung dieser parasitären Erkrankung wird hauptsächlich durch Chemotherapie (z. B. Antikokzidiika) und Impfungen erreicht. Aufgrund zunehmender Bedenken hinsichtlich der Resistenz gegen antiparasitäre Arzneimittel wurden jedoch umfangreiche Forschungsarbeiten durchgeführt, die darauf abzielten, neue alternative oder ergänzende Strategien zur Bekämpfung von Kokzidiose in Vogelsammlungen zu entwickeln, einschließlich Futterverbesserung, Hausreinigung und -desinfektion sowie natürlicher Lösungen wie Kräuterextrakte, die unerlässlich sind Öle, Probiotika und Präbiotika sowie Algen5,6,7,8,9. In jüngerer Zeit haben portugiesische, spanische, brasilianische und dänische Forscher den Einsatz von Raubpilzen (auch bekannt als „nematophage Pilze“ oder „helmintophage Pilze“) mit larviziden und oviziden Eigenschaften als Ergänzung zu antiparasitären Arzneimitteln zur Bekämpfung von Magen-Darm-Parasiten vorgeschlagen Infektionen bei Haus- und Exotenvögeln10.

Die biologische Bekämpfung parasitärer Magen-Darm-Infektionen bei Tieren mit Raubpilzen hat sich bereits als genaue und nachhaltige Ergänzung zu antiparasitären Medikamenten erwiesen und eine Wirksamkeit von bis zu 97 % bei der Reduzierung der Parasiteneierausscheidung (Anzahl der Eier pro Gramm Kot, EPG) bei Pferden erreicht und Wiederkäuer11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Allerdings haben nur wenige In-vitro- und In-vivo-Studien die Leistung von Raubpilzen gegen Parasiten untersucht, die andere tierische Wirte befallen, nämlich Vögel, Hunde, Waschbären und Wapitis10,19,24,25,26,27,28.

Auch räuberische Pilze sind für ihre Allgegenwärtigkeit bekannt, da sie größtenteils aus landwirtschaftlich genutzten Böden, verrottenden organischen Stoffen und tierischen Fäkalien isoliert wurden29. Studien, die in Amerika, Europa, Asien, Ozeanien und der Antarktis durchgeführt wurden, haben über die Isolierung von Fadenpilzen berichtet, die in der Lage sind, vor intestinalen parasitären Formen zu leben, und zwar aus dem Kot einer großen Vielfalt an Tierarten, darunter Schafe, Ziegen und Rinder30,31,32, 33,34; Wasserbüffel35; Esel34; Nasenbär, Waschbär, Eurasischer Luchs, Braunbär, Mufflon, Gazelle, Bison, Dromedar, Guanako und Wallaby33; und Pferde31,33. Die am häufigsten isolierten Taxa räuberischer Pilze mit larviziden Eigenschaften sind Duddingtonia flagrans (Dudd.) RC Cooke (1969), Arthrobotrys spp. und Monacrosporium spp., während Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare & W. Gams (2001), Mucor circinelloides Tiegh (1875), Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa-ard, Houbraken, Hywel-Jones & Samson (2011), Verticillium spp. und Trichoderma spp. haben nachweislich ovizide Eigenschaften17,29,36. Dennoch wurde in der wissenschaftlichen Literatur noch nicht über Studien zur Isolierung dieser Pilze aus Vogelkotproben berichtet.

Die aktuelle Forschung zielte darauf ab, einheimische Fadenpilze aus Kotproben von Haus- und Exotenvögeln zu isolieren und ihre in vitro räuberische Aktivität auf Kokzidien-Oozysten zu bewerten.

Aus dem Pool von 58 Fäkalien von Hühnern, Legehennen und Pfauen konnten sieben Isolate von Fadenpilzen gewonnen werden: drei von Hühnern (FR1, FR2 und FR3) und vier von Pfauen (SJ1 und SJ2 – Sammlung exotischer Vögel SJ ; QP1 und QP2 – Sammlung exotischer Vögel (QP).

Die makroskopische und mikroskopische Pilzcharakterisierung ergab für die meisten Isolate ähnliche Ergebnisse: eiförmige und hyaline Konidien, ohne Septen; gelbliche und unverzweigte Sporangien, getragen von einer Columella; Hyphen ohne Septen; grauweiße und flauschige Kolonien. Allerdings hatte das Isolat QP1 Konidien mit länglicher Form und dünnere Hyphen als die anderen Isolate (Abb. 1; Tabelle 1). Somit ermöglichte die morphologische Beurteilung die mutmaßliche Identifizierung aller Isolate als Mucor sp. Es wurden keine weiteren Pilztaxa identifiziert.

Konidien, Sporangien und Hyphen von Mucor-Isolaten (FR1 – M. circinelloides; FR2 – M. circinelloides; FR3 – M. circinelloides; SJ1 – M. circinelloides; SJ2 – M. circinelloides; QP1 – M. lusitanicus; QP2 – M. circinelloides; Circinelloides; Originale).

Durch das Hochladen der ITS1-5.8S-ITS2-Sequenzen in die Blastn Suite konnte für jedes Pilzisolat eine Top 3 der Ähnlichkeit ermittelt werden: FR1 wies über 99,5 % Ähnlichkeit mit zwei Mucor circinelloides-Stämmen auf (GenBank-Zugangsnummern OW988287 und OW985400); FR2 hatte eine Ähnlichkeit von über 99 % mit drei M. circinelloides-Stämmen (FN598920, HQ914900 und KJ584557); FR3 hatte 99,8 % Ähnlichkeit mit zwei M. circinelloides-Stämmen (MK396486 und KT336541); SJ1 hatte 100 % Ähnlichkeit mit drei M. circinelloides-Stämmen (KX620480, OW987678 und OW987665); SJ2 hatte eine Ähnlichkeit von über 99,5 % mit drei M. circinelloides-Stämmen (MT991775, NR_126116 und FJ713065); QP1 hatte eine Ähnlichkeit von 99,8 % mit Mucor sp. (MK164174), Mucor lusitanicus (OP163597) und Mucor racemosus (MN726736); und QP2 hatte 100 % Ähnlichkeit mit zwei M. circinelloides-Stämmen (MT603934 und OW988287) (Tabelle 2).

Phylogenetische Analyse der ITS1-5.8S-ITS2-Sequenzen aller Isolate unter Verwendung der Stämme Mucor circinelloides CBS 195.68, Mucor lusitanicus CBS 108.17, Mucor racemosus f. Racemosus CBS 260.68 und Mucor fragilis, die ebenfalls aus der BLAST-Analyse gewonnen wurden, ermöglichten die Identifizierung der Isolate FR1, FR2, FR3, SJ1, SJ2 und QP2 als Mucor circinelloides-rDNA-Sequenzen, während das Isolat QP1 als Mucor lusitanicus identifiziert wurde (Abb. 2).

Phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit basierend auf der ITS1-5.8S-ITS2-Region, einschließlich der Sequenzen von Isolaten und GenBank-Referenzstämmen. Der Bootstrap der Wahrscheinlichkeit wird in jedem Zweig angezeigt und es wurden nur Werte über 50 berücksichtigt. Alle sieben Mucor-Isolate werden in Fettschrift angezeigt, gefolgt von ihren jeweiligen GenBank-Zugangsnummern. Farbige Quadrate stellen die Vogelsammlungen dar, aus denen Pilze gewonnen wurden: blau – Hühner; Grün und Orange – Pfauen aus den exotischen Kollektionen SJ bzw. QP.

In-vitro-Studien ergaben, dass alle Isolate sowohl im WA-Medium (Abb. 3) als auch in Koprokulturen (Abb. 4) eine räuberische Aktivität gegen Eimeria-Oozysten entwickelten. Es konnte beobachtet werden, dass die Anwesenheit von Oozysten die Entwicklung von Pilzhyphen und deren Anheftung an die Kapseln der Oozysten auslöste (Aktivitätstyp 1). Während der 30-tägigen Pilzexposition begannen die Oozysten außerdem, ihre Morphologie zu verändern, ihre inneren Strukturen waren nur schwach ausgeprägt und es bildeten sich Vakuolen (Typ 2), bis sich Sporen innerhalb der Oozystenzelle zu vermehren begannen und schließlich zu deren Zerstörung führten (Typ 3).

Von Mucor-Isolaten entwickelte Prädation gegen Kokzidien-Oozysten in WA-Medium (FR1 – M. circinelloides; FR2 – M. circinelloides; FR3 – M. circinelloides; SJ1 – M. circinelloides; SJ2 – M. circinelloides; QP1 – M. lusitanicus; QP2 –M. circinelloides; Originale).

Eimeria sp. Oozysten, die nach Koprokulturen mit Pilzen unterschiedliche morphologische Veränderungen zeigen (A, C, E – Verformung der Oozystenkapsel; B, D – Zerstörung der Oozyste und Verlust des Zytoplasmainhalts; F – sporulierte Oozyste; Originale).

Pilzisolate zeigten unterschiedliche lytische Leistungen, wenn sie der fäkalen Mikroumgebung ausgesetzt wurden (Versuch mit Plastikbechern), was die Reduzierung der Kokzidiensporulation und die Schädigung der Oozystenstruktur angeht: Die Isolate FR3, QP2, SJ1, SJ2 und FR2 hatten eine signifikante Reduktionswirksamkeit von 85 % (p < 0,001), 85 % (p < 0,001), 73 % (p = 0,001), 69 % (p = 0,001) bzw. 65 % (p = 0,003) hinsichtlich der Begrenzung der Sporulation von Oozysten, während die Isolate FR1, QP2 und QP1 hatte eine signifikante Reduktionseffizienz von 22 % (p < 0,001), 14 % (p < 0,001) bzw. 8 % (p = 0,01) bei der Zerstörung der Oozysten, allerdings erst nach 14 Tagen Exposition. Außerdem war die ovizide Wirksamkeit zeitabhängig, da sich die Lebensfähigkeit der Oozysten zwischen der ersten und zweiten Versuchswoche nach Exposition gegenüber den Isolaten FR1 (p < 0,001) und QP1 (p = 0,001) deutlich unterschied. Die Lebensfähigkeit der Oozysten blieb im Kontrollbecher während des Tests stabil, mit einem Prozentsatz der Lebensfähigkeit von 97 % bzw. 94 % nach 1 bzw. 2 Wochen Inkubation (Tabelle 3), wobei zwischen beiden Wochen keine statistischen Unterschiede festgestellt wurden (S = 0,302).

Raubpilze sind eine Gruppe saprophytischer Fadenpilze, die für ihre Fähigkeit bekannt sind, Larven, Eier und Oozysten von Parasiten, die Tiere und Pflanzen befallen, zu fressen und zu zerstören. Neben diesen funktionellen Eigenschaften zeichnen sie sich auch durch andere Eigenschaften aus, nämlich die Möglichkeit, aus einer Vielzahl von Umweltproben isoliert zu werden, darunter landwirtschaftliche Böden, verrottende organische Stoffe und tierische Fäkalien. Ihre Isolierung aus Fäkalien, die häufig auch Umweltformen von Darmparasiten beherbergen, beweist, dass Pilze und Parasiten auf natürliche Weise Beziehungen in der Mikroumgebung von Fäkalien und Boden aufbauen, wobei erstere eine Nahrungsquelle für Raubpilze darstellen17,29,36. Auch die Isolierung dieser Art von Pilzen aus dem Kot gesunder Tiere zeigt das Gleichgewicht, in dem sich diese Mikroorganismen in der Darmumgebung befinden, und damit ihre Unschädlichkeit für immunkompetente Tiere17,19,20,28,37,38,39.

Unseres Wissens gelang es dieser Studie erstmals, Fadenpilze mit räuberischen Fähigkeiten aus Vogelkotproben zu isolieren, was darauf hindeutet, dass Vögel auch „natürliche Ausscheider“ dieser Art von Pilzen sind, wie bereits von mehreren Autoren für Säugetierarten, nämlich Wiederkäuer, berichtet wurde , Pferde und Fleischfresser, die in Bauernhöfen und zoologischen Parks gehalten werden30,31,32,33,34,35.

Für diese Forschung ermöglichte die Verwendung von Vogelkotproben, die positiv auf Darmparasiten waren, zusammen mit ihrer anfänglichen Inokulation auf einem minderwertigen Medium wie Wasser-Agar, die Gruppen von Pilzen einzuschränken, die sich in diesem Medium entwickeln konnten, und das Wachstum nur potenzieller Raubtiere zu stimulieren Pilze. Neben WA-Medium umfassten die Isolierungsschritte auch Weizenmehl-Agar für schnelles Hyphenwachstum, Reinigung und Lagerung12. Die Verwendung dieser beiden Medien ohne Antibiotikazusatz ermöglichte die präzise Isolierung und Lagerung von Raubpilzen in einem schnelleren und wirtschaftlicheren Ansatz im Vergleich zu anderen nährstoffreicheren Medien wie Sabouraud-Agar, Maismehl-Agar, Kartoffel-Dextrose-Agar oder Malzextrakt-Agar. die für diese Verfahren häufig mit Chloramphenicol ergänzt werden.

An allen ausgewählten Standorten und von den beiden verwendeten Vogelmodellarten wurden Isolate von Fadenpilzen gewonnen, obwohl aus Legehennenproben keine Isolate gewonnen wurden. Die morphologische Analyse ließ den Schluss zu, dass alle Isolate zur Gattung Mucor gehören, wobei die qualitativen und quantitativen Ergebnisse für Konidien, Sporangien und Hyphen mit der veröffentlichten Literatur zu dieser Gattung übereinstimmen40,41. Außerdem führte die molekulare Bewertung auf der Grundlage von rDNA-ITS1-5.8S-ITS2-Sequenzen zur Identifizierung zweier Pilzarten, Mucor circinelloides (FR1, FR2, FR3, SJ1, SJ2 und QP2) und Mucor lusitanicus (QP1), und bewies damit, dass diese Pilzarten vorkommen Zielsequenzen eignen sich tatsächlich für die molekulare Identifizierung von Raubpilzen, wie in anderen Studien gezeigt wurde34,42,43,44,45.

Alle Pilzisolate entwickelten eine lytische Aktivität gegen Kokzidien-Oozysten im WA-Medium und in der fäkalen Mikroumgebung, was die Identifizierung aller Stadien der räuberischen Aktivität ermöglichte. Beim ersten Test unterschieden sich die Wirksamkeiten vor der Datierung zwischen den Stämmen, wobei FR1 und QP2 bei der Zerstörung von Eimeria spp. am genauesten waren. Oozysten (Wirksamkeiten von 22 % bzw. 14 %), während die Stämme FR3, QP2 und SJ1 signifikante kokzidiostatische Wirksamkeiten von mehr als 70 % aufwiesen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien portugiesischer und spanischer Forscher27,33, die eine in vitro räuberische Aktivität von M. circinelloides gegen Eier und Oozysten von Darmparasiten zeigten, die verschiedene tierische Wirte befallen. Darüber hinaus handelt es sich um den ersten Original-Forschungsartikel, der über die kokzizide und kokzidiostatische Wirkung von Mucor spp. berichtet. gegen Vogelkokzidien. Die aktuelle Forschung enthüllt außerdem zum ersten Mal die von M. lusitanicus entwickelten räuberischen Fähigkeiten gegen parasitäre Formen, die einen erheblichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Oozysten nach 14-tägiger Inkubation hatten (8 %), obwohl sie eine geringere Wirksamkeit aufwiesen als die erhaltenen für die anderen Sorten. Die Fähigkeit von Mucor spp. Darmparasitäre Formen vor Vögeln zu verhindern, ist eine der Forschungslinien spanischer und portugiesischer Autoren, die der COPAR-Forschungsgruppe (Fakultät für Veterinärmedizin – Universität Santiago de Compostela) bzw. der LPPD (Fakultät für Veterinärmedizin – Universität Lissabon) angehören.

Die Entdeckung signifikanter Ergebnisse für die kokzizide Aktivität von Pilzen erst nach 14 Tagen Inkubation und die signifikanten Unterschiede zwischen den Daten von 7 und 14 Tagen für die Isolate FR1 und QP1 bestätigen, dass die räuberische Aktivität, die diese Art von Pilzen entwickelt, allmählich und zeitlich erfolgt -abhängiger Prozess. Es ist die Anwesenheit des Parasiten, die die Entwicklung von Pilzhyphen in Richtung des Parasiten und deren Anheftung an seine Kapsel auslöst17,27,29,33,36. Die Migration von Pilzhyphen zu Eiern und Oozysten von Parasiten kann als eine der kritischsten Phasen des Raubtierprozesses angesehen werden. Hyphen müssen wachsen und den Parasiten erreichen. Dieser Prozess kann durch natürliche biotische und abiotische Faktoren in der fäkalen Mikroumgebung verzögert werden und somit die Leistung und Geschwindigkeit der Pilzwirkung beeinträchtigen. Die fäkale Vogelmikrobiota, die aus einer großen Vielfalt einheimischer Mikroorganismen besteht, nämlich Bakterien der Phyla Firmicutes und Proteobacteria46, Pilzen der Phyla Ascomycota und Basidiomycota47 sowie anderen Mikroorganismen, könnte die Leistung jedes Pilzstamms negativ beeinflusst haben Ressourcenkonkurrenz und Abbau der Pilzstämme. Es wurde vermutet, dass das Überleben räuberischer Pilze im Boden und in der fäkalen Mikroumgebung durch biotische Faktoren wie das Vorhandensein von Mikroorganismen mit fungistatischen Eigenschaften beeinflusst wird48. Darüber hinaus hat eine in Dänemark durchgeführte Studie49 gezeigt, dass die Raubtierleistung von Pochonia chlamydosporia und Metarhizium brunneum, zwei oviziden Pilzarten, im Boden gegen Vogelspulwürmer (Ascaridia galli und Heterakis gallinarum) durch die Mikrobiota des Bodens beeinflusst wird. Alle diese Faktoren müssen bei der Planung eines Biokontrolltests berücksichtigt werden, insbesondere die optimale Dosierung der Sporen, um diesen begrenzenden Faktoren entgegenzuwirken.

Da schließlich alle Mucor-Stämme aus frischen Kotproben von Vögeln isoliert wurden und eine interessante lytische Aktivität auf Kokzidien-Oozysten zeigten, kann angenommen werden, dass diese Stämme der Magen-Darm-Passage bei Hühnern und Pfauen widerstanden und sowohl ihre Keimungs- als auch ihre Raubtierfähigkeiten beibehielten zuvor bei Vögeln für den oviziden Pilz P. chlamydosporia50 und die larviziden Pilze D. flagrans und Monacrosporium thaumasium51 nachgewiesen. Die Tatsache, dass alle Mucor-Isolate aus dem Kot gesunder Vögel gewonnen wurden, lässt auch darauf schließen, dass sie für immunkompetente Vögel harmlos sind, wie andere Forscher für Pferde37, Schafe20, Hunde28 und Wapitis19 gezeigt haben.

Unseres Wissens nach war diese Studie weltweit die erste, die darauf abzielte, einheimische Raubpilze aus Vogelkot zu isolieren und zu identifizieren und ihre In-vitro-Wirksamkeit gegen Vogeleimeria spp. zu testen. Oozysten. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Mucor circinelloides-Stämme FR1 und QP2 die vielversprechendsten für den Einsatz in zukünftigen In-vitro- und In-vivo-Biokontrollversuchen sind.

Insgesamt 89 Kotproben von freilaufenden Hühnern und Legehennen (Gallus gallus Domesticus; n = 46) und Pfauen (Pavo cristatus; n = 43) wurden zuvor mit verschiedenen koprologischen Techniken wie McMaster, Mini-FLOTAC und untersucht Koprokulturen im Rahmen einer kürzlich am Labor für Parasitologie und parasitäre Krankheiten (LPPD) der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Lissabon 3 durchgeführten Studie, in der festgestellt wurde, dass 58 Proben (65 %) positiv auf mindestens ein gastrointestinales Parasitentaxon waren , nämlich Kokzidien der Gattung Eimeria, und Nematoden wie Capillaria sp., Trichostrongylus tenuis und Strongyloides pavonis. Die Proben stammten von gesunden Tieren, die keine klinischen Anzeichen von Magen-Darm-Erkrankungen, nämlich Durchfall und/oder Kot mit Blut, aufwiesen.

Diese Proben wurden zwischen Juli 2020 und April 2021 in einer Geflügelfarm (PF) und zwei Sammlungen exotischer Vögel in den Distrikten Lissabon (SJ) und Santarém (QP) (Portugal) gesammelt. Die Geflügelfarm liegt im Nordwesten Lissabons (39°13′54,373″ N 9°17′2,235″ W) und beherbergt zwei separate Populationen von 200 Freilandhühnern und 200 Legehennen sowie die exotischen Vogelsammlungen SJ und QP haben 20 bzw. 3 Pfauen und liegen im Zentrum von Lissabon (38°42′50.241″ N 9°8′2.182″ W) bzw. Abrantes (39°26′52.595″ N 8°10′24.949″ W).

Stuhlproben wurden unmittelbar nach der Ausscheidung gesammelt, in Plastiktüten verpackt und zum LPPD transportiert, wo sie bis zur weiteren Verarbeitung maximal eine Woche lang im Kühlschrank (4 °C) gelagert wurden.

Insgesamt 58 Vogelkotproben, die positiv auf Magen-Darm-Parasiten waren, wurden sowohl am LPPD als auch am Labor für Mykologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Lissabon (Portugal) zur Isolierung und Identifizierung von Fadenpilzen verwendet. Die Idee, nur diese Proben zu verwenden, basierte auf der Annahme, dass die Hauptfähigkeit dieser Art von Pilzen darin besteht, Parasiteneier, Oozysten und Larven zu räubern und zu zerstören, und dass dieses Verfahren daher das Wachstum potenzieller Raubpilze stimulieren und deren Entwicklung einschränken würde andere Pilzgruppen.

Zu diesem Zweck wurde etwa 1 g jeder Stuhlprobe auf die Oberfläche eines Wasser-Agar-Mediums (WA, 2 %) gegeben und dann 3 Wochen lang bei 26 °C inkubiert. Sobald das Wachstum von Fadenpilzen aufgezeichnet wurde, wurden einzelne Kolonien 3–4 Passagen unter Verwendung von Weizenmehl-Agar (WFA, 2 %) und Inkubationszyklen von 26 °C für eine Woche unterzogen, bis Reinkulturen entstanden. Für jede Stuhlprobe wurden zwei Replikate verwendet33.

Alle Isolate wurden einer morphologischen Identifizierung auf Gattungsebene unterzogen, basierend auf Hernández et al.33, Arroyo-Balán et al.34, Ocampo-Gutiérrez et al.42 und Cooke und Godfrey52. Messungen (Länge und Breite) und Morphologiebeschreibung wurden für insgesamt 10 Sporangien und Hyphen (200-fache und 400-fache Gesamtvergrößerung) und Konidien (1000-fache Gesamtvergrößerung, in Immersionsöl) unter Verwendung einer Lactophenol-Baumwollblau-Färbung und eines Lichtmikroskops durchgeführt . Außerdem wurde für jedes Isolat eine makroskopische Charakterisierung der Kolonien hinsichtlich ihrer Textur und Farbe durchgeführt.

Für jedes Isolat wurden Sporensuspensionen mit destilliertem Wasser hergestellt und ihre Endkonzentration mithilfe der Neubauer-Kammer berechnet. Alle Pilzsuspensionen wurden auf 106 Sporen/ml standardisiert.

Pilzisolate wurden in Petrischalen und Glaskolben mit WFA bei Raumtemperatur konserviert, und 850 μl jeder wässrigen Pilzsuspension wurden bei –20 °C in Kryoröhrchen mit 15 % (v/v) sterilem Glycerin gelagert40.

Die DNA-Extraktion aus allen Pilzisolaten wurde mit dem EZNA® Fungal DNA Mini Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA) durchgeführt. Ein kalibrierter 1-μL-Tupfer wurde verwendet, um frisches Myzel von jedem Pilzisolat zu sammeln. Dieser Vorgang wurde fünfmal wiederholt und das gesamte Myzelvolumen in die entsprechenden 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, denen außerdem 600 μl Lysepuffer FG1 zugesetzt wurden. Die Mischung wurde verwirbelt, um alle Klumpen zu zerstreuen, und 10 Minuten lang bei 65 °C inkubiert. Anschließend wurden 140 μl FG2-Puffer (Eisessig) zugegeben und die Suspension verwirbelt. Die Röhrchen wurden 5 Minuten lang auf Eis inkubiert und dann 10 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden in neue Mikrozentrifugenröhrchen überführt, denen außerdem 0,7 Volumina Isopropanol zugesetzt wurden. Nach dem Vortexen wurden die Suspensionen 2 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden abgelassen und jedem DNA-Pellet 300 μl steriles destilliertes Wasser zugesetzt und dann verwirbelt. In jedes Röhrchen wurden insgesamt 4 μl RNase A gegeben, gefolgt von 150 μl FG3-Puffer (Guanidinhydrochlorid) und 300 μl 100 % Ethanol, wobei die Suspensionen stets mit dem Vortex gemischt wurden. Weitere Schritte wurden mit HiBind® DNA Mini-Säulen durchgeführt, um Polysaccharide, Phenolverbindungen und Enzyminhibitoren aufgrund ihrer reversiblen Nukleinsäurebindung aus Pilzlysaten zu entfernen. Reine DNA wurde in 200 μl sterilem destilliertem Wasser eluiert und ihre Reinheit und Konzentration mit NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) überprüft. Die Röhrchen wurden schließlich bei –20 °C gelagert.

Die Amplifikation der rDNA wurde für jedes Isolat, das auf die ITS1-5.8S-ITS2-Region abzielte, unter Verwendung von 10–66 ng genomischer DNA und den Primern ITS1 (TCC GTA GGT GAA CCT GCG G) und ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) durchgeführt. Diese Verfahren folgten den von Arroyo-Balán et al.34 und Lau et al.53 beschriebenen Richtlinien und die PCR-Reaktion wurde in einem 25-μL-Volumen durchgeführt, bestehend aus: 0,4 μL ITS1 (0,8 μM), 0,4 μL ITS4 (0,8 μM). ), 10 μL DNA-Vorlage, 10 μL NZYTaq II Green Master Mix (NZYTech, Lissabon, Portugal) und 4,2 μL molekularbiologisches Wasser. Es wurde auch eine Negativkontrolle verwendet, indem Wasser durch DNA ersetzt wurde.

Die Thermocycling-Bedingungen waren die folgenden: ein anfänglicher Denaturierungsschritt bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 60 Zyklen, bestehend aus einem Denaturierungsschritt bei 94 °C für 15 Sekunden, einem Annealing-Schritt bei 55 °C für 30 Sekunden und einem Verlängerungsschritt bei 72 °C für 30 s. Abschließend wurde ein Verlängerungsschritt für 5 Minuten bei 72 °C durchgeführt. Die Amplikons wurden durch Agarosegel-Elektrophorese (1,5 %) analysiert, mit 2,5 μl GreenSafe Premium (NZYTech) gefärbt und enthielten die NZYDNA-Leiter VI (50–1500 bp; NZYTech). Das Gel wurde 40 Minuten lang bei 85 V betrieben und mit dem Gerät ChemiDoc und der Image Lab™ Software (Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornien, USA) sichtbar gemacht.

Jedes PCR-Produkt wurde unter Verwendung von Magnetkügelchen (MCLAB, Kalifornien, USA) zur DNA-Fällung gereinigt, gefolgt von einer Pelletwäsche mit 85 % Ethanol und anschließender Elution in MiliQ-Wasser. Die erhaltenen Überstände wurden für die weitere Sequenzierung verwendet. Gereinigte PCR-Produkte wurden mit dem ITS1-Primer und dem BigDye™ Terminator Version 3.1 Cycle Sequencing Kit sowie mit dem DNA-Analysator 3730 XL (Thermo Fisher Scientific Inc.) sequenziert.

Die Sequenzen wurden mit Chromas Software, Version 2.6.6 (Technelysium Pty, Ltd., South Brisbane, Australien) bewertet und ihre Qualität anhand genau definierter Peaks der Nukleotide in den Chromatogrammen überprüft. Die Sequenzen wurden dann mit der Blastn Suite (BLAST®) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) gesprengt, um eine vorläufige Analyse der Sequenzen mit signifikanten Alignments durchzuführen und Pilztaxa für Vergleichszwecke in der phylogenetischen Analyse auszuwählen. Für jedes Pilzisolat wurde basierend auf den Ergebnissen von Blastn Suite eine Top 3 der Sequenzähnlichkeit ermittelt.

Die Sequenzen wurden manuell mit der MEGA-Software, Version 11.0.1154, bearbeitet, um die Qualität der Sequenzen und nicht erkannten Nukleotide zu überprüfen, Primer zu entfernen und ihre Ausrichtung mithilfe des MUSCLE-Algorithmus durchzuführen. Basierend auf der BLAST®-Suche wurden Sequenzen der ITS1-5.8S-ITS2-Region aus den Isolaten Mucor circinelloides CBS 195.68 (Zugangsnummer: NR_126116.1), Mucor lusitanicus CBS 108.17 (Zugangsnummer: NR_126127.1), Mucor racemosus f. Racemosus CBS 260.68 (Zugangsnummer: NR_126135.1) und Mucor fragilis (Zugangsnummer: FJ904925.1) waren ebenfalls enthalten. Der IQ-TREE-Webserver55 wurde verwendet, um aus 1000 Replikationen einen phylogenetischen Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit zu erstellen. Die ModelFinder-Option von IQ-TREE wurde für die automatische Ermittlung des besten Modells56 eingestellt. Das ultraschnelle Bootstrapping-Tool (1000 Bootstrapping-Alignments) wurde ausgewählt, um Statistiken zur Knotenunterstützung zu erhalten, wobei seine Zweige nur durch Bootstrap-Werte über 5057 unterstützt werden. Der phylogenetische Baum wurde mit der MEGA-Software visualisiert und bearbeitet, und M. racemosus wurde als Wurzel des Baums ausgewählt , da dieser Referenzstamm im anfänglichen phylogenetischen Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit deutlich phylogenetisch weiter von den anderen Pilzisolaten und Referenzstämmen entfernt war und sowohl die Wurzelbildung des Baums auf diesem Stamm als auch auf Midpoint zu identischen phylogenetischen Bäumen führte.

Die ITS1-5.8S-ITS2-Nukleotidsequenzen aller sieben Pilzisolate wurden in der GenBank-Datenbank unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt: ON150886 (M. circinelloides, FR1), ON150887 (M. circinelloides, FR2), ON150888 (M. circinelloides, FR3), ON150889 (M. lusitanicus, QP1), ON150890 (M. circinelloides, QP2), ON150891 (M. circinelloides, SJ1) und ON150892 (M. circinelloides, SJ2).

Es wurden zwei Arten von Biokontrollversuchen durchgeführt, um die räuberische Aktivität aller Pilzisolate gegen Vogelkokzidien zu testen: ein qualitativer Test in Petrischalen mit WA-Medium und ein quantitativ-qualitativer Koprokulturtest33.

Um konzentrierte Suspensionen von Oozysten zu erhalten, wurden Kotproben von Hühnern, Legehennen und Pfauen, die positiv auf Eimeria spp. waren, mit der Willis-Flotationstechnik verarbeitet. Kurz gesagt, zwei Gramm Kot wurden mit 28 ml gesättigter Saccharoselösung (spezifisches Gewicht 1,2) gemischt; Die Stuhlsuspension wurde filtriert und in 10-ml-Reagenzgläser gegossen, bis sich ein konvexer Meniskus bildete, auf den ein Deckglas gelegt wurde. Die Reagenzgläser wurden 10 Minuten lang auf dem Labortisch belassen und das Deckglas wurde dann mit destilliertem Wasser in neue Reagenzgläser gewaschen, die 10 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert wurden. der Überstand wurde teilweise entfernt, so dass nur noch 1 ml in jedem Röhrchen übrig blieb; Sediment und Überstand wurden mit einer Pasteurpipette gemischt und 100 μl der Oozystensuspension wurden mit einem Lichtmikroskop bei 400-facher Gesamtvergrößerung sichtbar gemacht. Es wurden zwei Messungen durchgeführt und die Gesamtzahl der Oozysten mit 10 multipliziert, um die Kokzidienkonzentration (dh Oozysten/ml) zu berechnen.

Im ersten Test wurde ein Gesamtvolumen von 500 μl jedes Pilzisolats (106 Sporen/ml) auf die Oberfläche des WA-Mediums geimpft, zu dem auch 1 ml Oozystensuspension hinzugefügt wurde, mit einer mittleren Konzentration von 140 Oozysten/ml . Für jedes Isolat wurden zwei Replikate verwendet, und eine positive Kontrolle wurde auch verwendet, um das Überleben der Oozysten ohne Pilzimpfung und Testkontamination durch andere Pilzarten zu bewerten. Die Platten wurden mit Parafilm versiegelt und 30 Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Platten zur Identifizierung der räuberischen Aktivität beobachtet, die wie folgt charakterisiert wurde: Anheftung der Hyphen an die Oozystenkapsel, jedoch ohne morphologische Schäden (Aktivitätstyp 1); die Oozystenkapsel und die inneren Strukturen weisen morphologische Veränderungen auf, jedoch ohne Pilzdurchdringung (Typ 2); Hyphen dringen in das Zytoplasma der Oozyste ein, wachsen darin und zerstören es (Typ 3)27,33,58.

Der zweite Test zielte darauf ab, die Wirksamkeit der Pilzisolate beim Abbau der Oozysten nach Exposition gegenüber der fäkalen Mikroumgebung zu bewerten. Vier Gramm Pfauenkotproben aus der Exotensammlung SJ, positiv für Eimeria spp. (n = 20) wurden vorsichtig gemischt und in acht Plastikbecher gegeben. Insgesamt 4 ml Pilzsuspensionen (106 Sporen/ml) wurden in die jeweiligen Testbecher gegeben (einer pro Pilzisolat, n = 7), während 4 ml destilliertes Wasser in den Kontrollbecher gegossen wurden (n = 1). Anschließend wurden die Becher mit perforierter Aluminiumfolie abgedeckt und zwei Wochen lang bei 26 °C inkubiert. Nach ein- und zweiwöchiger Inkubation wurden in jedem Test- und Kontrollbecher zwei Flotationen durchgeführt, wobei 2 g Fäkalien, die zufällig aus verschiedenen Teilen der Probe entnommen wurden, mit 28 ml gesättigter Saccharoselösung (spezifisches Gewicht 1,2) gemischt wurden, mit dem Ziel Berechnen Sie den Anteil der sporulierten/unsporulierten und lebensfähigen/nicht lebensfähigen Oozysten (nach einer Woche) und den Anteil der lebensfähigen/nicht lebensfähigen Oozysten (in jeder Woche). In jeder Tasse und jedem Zeitrahmen wurden zwei Messungen durchgeführt, wobei pro Messung insgesamt 100 Oozysten gezählt wurden.

Für jedes Pilzisolat und jeden Zeitrahmen (7 und 14 Tage) wurden die Verringerung der Lebensfähigkeit der fäkalen Oozysten (FOVR) (1) und die Verringerung der Sporulation der fäkalen Oozysten (FOSR) (2) wie folgt berechnet19,20,59:

Die Charakterisierung des Aussehens der Oozysten wurde an die von Cazapal-Monteiro et al.27 für Spulwürmer-Eier festgelegten Verfahren angepasst, wobei Oozysten als nicht lebensfähig gelten, wenn mindestens eines der folgenden Merkmale beobachtet wurde: innere Strukturen schlecht markiert, Oozysten abnormale Form, Zytoplasma mit Vakuolen und/oder Kapselzerstörung.

Da die meisten Eimeria-Arten, die Galliformes befallen, bei Temperaturen zwischen 20 und 30 °C in weniger als 2 Tagen sporulieren5,60, wurde die FOSR-Bewertung nach folgenden Kriterien durchgeführt: Am Ende der ersten Inkubationswoche erfolgte die Identifizierung Die Anzahl nichtsporulierter Oozysten in den Testbechern wurde auf eine kokzidiostatische Aktivität zurückgeführt, die durch die Exposition gegenüber den jeweiligen Pilzisolaten entstand.

Für die Datenspeicherung sowie Tabellen- und Diagrammbearbeitung wurde die Software Microsoft® Excel® für Microsoft 365 MSO (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) verwendet.

Für die anfängliche deskriptive Statistik (Mittelwert und Standardfehler) wurde die Software IBM® SPSS® Statistics Version 27 für Windows (IBM Corporation, Armonk, NY, EUA) verwendet. Außerdem wurde diese Software verwendet, um 2 × 2-Tabellen unter Verwendung von Daten aus dem In-vitro-Versuch (Lebensfähigkeit und Sporulation) zu erstellen, mit dem Ziel, einen Chi-Quadrat-Test durchzuführen, um die Ergebnisse zwischen den Oozysten zu vergleichen, die jedem Pilzisolat ausgesetzt waren (Testbecher). ) und zum Wasser (Kontrollbecher). Darüber hinaus wurde dieser Test verwendet, um die Zeitabhängigkeit der oviziden Aktivität zu beurteilen, die jedes Pilzisolat an Oozysten entwickelt. Für alle Tests wurde ein Signifikanzniveau von p < 0,05 verwendet.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze gehören dem Zentrum für interdisziplinäre Forschung in der Tiergesundheit (CIISA) der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Lissabon. Von allen sieben Mucor-Isolaten erhaltene rDNA-Sequenzen wurden am 5. April 2022 in die GenBank-Datenbank hochgeladen, wobei die Zugangsnummern im Abschnitt „Methoden“ angegeben sind. Alle Daten können auf Anfrage beim korrespondierenden Autor zur Verfügung gestellt werden.

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Diese Forschung wurde durch die CIISA/FMV-Projekte UIDB/00276/2020 und LA/P/0059/2020 – AL4AnimalS (beide finanziert durch FCT) sowie durch das Projekt ED431B 2021/07 (Consellería de Cultura, Educación e Universidades, Xunta) finanziert de Galicia). Außerdem sind João Lozano und Mariana Louro Inhaber der PhD-Forschungsstipendien 2020.09037.BD bzw. UI/BD/152818/2022 (beide finanziert von FCT). Wir möchten den Laboratorien für Parasitologie und parasitäre Krankheiten sowie Mikrobiologie und Immunologie (CIISA-FMV, Lissabon, Portugal) und ihren Leitern, den Professoren Doktoren Isabel Fonseca und Luís Tavares, dafür danken, dass sie diese Forschung unterstützt und ermöglicht haben Führen Sie es in den jeweiligen Einrichtungen durch. Besonderer Dank geht außerdem an die COPAR-Forschungsgruppe (Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Santiago de Compostela, Lugo, Spanien) für die Unterstützung bei der Isolierung und Identifizierung von Raubpilzen und den In-vitro-Versuchen. Abschließend möchten wir STAB VIDA, Lda danken. (Caparica, Portugal) für die Reinigung und Sequenzierung der Pilz-PCR-Produkte.

CIISA – Zentrum für interdisziplinäre Forschung in der Tiergesundheit, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Lissabon, Avenida da Universidade Técnica, 1300-477, Lissabon, Portugal

João Lozano, Mariana Louro, Ana Cláudia Victório, Manuela Oliveira und Luís Madeira de Carvalho

Assoziiertes Labor für Tier- und Veterinärwissenschaften (AL4AnimalS), 1300-477, Lissabon, Portugal

João Lozano, Mariana Louro, Ana Cláudia Victório, Manuela Oliveira und Luís Madeira de Carvalho

Exoclinic – Veterinärklinik für Vögel und Exoten, Quinta de Santo António, 1495-049, Miraflores, Portugal

Cristina Almeida

Vetnatura – Serviços Veterinários, Lda., Calçada de Palma de Baixo, 1600-176, Lissabon, Portugal

Pedro Melo

Rinde – Biopark Barquinha, 2260-999, Vila Nova da Barquinha, Portugal

Joao Paulo Rodrigues

Forschungsgruppe zur Bekämpfung von Parasiten (COPAR, GI-2120), Abteilung für Tierpathologie, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Santiago de Compostela, 27142, Lugo, Spanien

Adolfo Paz-Silva

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JL entwarf die Studie, stellte Ressourcen zur Verfügung, führte die Experimente durch, kuratierte die Daten, analysierte die Ergebnisse und verfasste den Originalentwurf des Manuskripts. ML stellte Ressourcen bereit, analysierte die Ergebnisse und überarbeitete das Manuskript. CA stellte Ressourcen zur Verfügung und überarbeitete das Manuskript. ACV stellte Ressourcen zur Verfügung und überarbeitete das Manuskript. PM stellte Ressourcen zur Verfügung. JPR stellte Ressourcen zur Verfügung. MO stellte Ressourcen zur Verfügung, arbeitete an den Experimenten mit, überarbeitete das Manuskript und betreute die Studie mit. APS stellte Ressourcen zur Verfügung, arbeitete an den Experimenten mit, überarbeitete das Manuskript und betreute die Studie mit. LMC stellte Ressourcen zur Verfügung, arbeitete an den Experimenten mit, überarbeitete das Manuskript und überwachte die Studie. Alle Autoren haben dieses Manuskript gelesen und der Einreichung zugestimmt.

Korrespondenz mit Joao Lozano.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lozano, J., Louro, M., Almeida, C. et al. Isolierung saprophytischer Fadenpilze aus Vogelkotproben und Bewertung ihrer räuberischen Aktivität auf Kokzidien-Oozysten. Sci Rep 13, 8965 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36120-5

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Eingegangen: 24. Dezember 2022

Angenommen: 30. Mai 2023

Veröffentlicht: 02. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36120-5

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